CA19-9时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立

摘要

CA19-9是一种糖蛋白，在胰腺癌、胆管癌、结肠癌、胃癌等恶性肿瘤患者体内高水平表达，因此检测CA19-9的含量可以对相关恶性肿瘤进行早期筛查及辅助诊断。目前，临床上针对CA19-9的检测方法有许多，随着国家分级诊疗制度的建设，急需适用于基层医疗单位的床旁快速检测方法。　　随着体外诊断技术的快速发展，荧光免疫层析技术现已成为床旁快速检测的重要手段之一。基于此，本研究拟建立一种新型荧光免疫层析定量检测CA19-9的方法。主要采用杂交瘤技术制备CA19-9单克隆抗体，筛选出符合要求的CA19-9配对单克隆抗体用于荧光免疫层析检测方法的建立。在此基础上，利用荧光免疫层析技术，以羧基荧光微球为标记物，NC膜为载体，将筛选的CA19-9配对抗体分别进行标记和包被，并对试纸条制备过程中的主要原材料进行筛选，对工艺、最佳反应时间进行优化，制备定量检测血清中CA19-9的荧光免疫层析检测试纸条。通过对试纸条的线性范围、精密性、特异性等性能指标进行检测比对，以评价本研究建立的CA19-9荧光免疫层析定量检测方法。　　本研究筛选得到2对较优的CA19-9单克隆抗体配对组合，利用荧光免疫层析法进行进一步的应用筛选，其中以M-2E3、M-2D8作为配对抗体制备的试纸条的性能最优。经工艺优化，试纸条最佳检测时间为15min，得到的线性方程为y=0.0069x+0.0223，R2=0.9865，检测线性范围为12.5-800U/mL;最低检出限为9.74U/mL，批内变异系数与批间变异系数均小于15％，平均回收率为101％;试纸条37℃加速破坏24天稳定性良好，与罗氏CA19-9试剂盒（电化学发光法）平行检测50份临床样本，R2=0.9886，回归方程为y=0.9884x+3.8191，相关性良好。　　本研究成功制备了适用于荧光免疫层析检测方法的CA19-9配对单克隆抗体，初步建立了定量检测血清中CA19-9的荧光免疫层析检测方法，有较好的临床应用前景。

目录

摘要

引言

缩略语与符号表

第一章 综述

1．1 肿瘤标志物

1．2 CA19-9概述

1．2．3 与CA19-9相关肿瘤

1．3 CA19-9的主要检测方法

1．3．1 放射免疫测定法

1．3．2 酶联免疫法

1．3．3 化学发光免疫分析法

1．3．4 电化学发光免疫法

1．3．5 荧光免疫分析法

1．3．6 胶体金免疫层析法

1．3．7 时间分辨荧光免疫层析法

1．4 本研究目的意义

1．5 本研究的主要内容

第二章 材料与方法

2．1 研究材料

2．1．1 免疫原

2．1．2 实验动物与细胞株

2．1．3 临床血清样本

2．1．4 主要试剂及材料

2．1．5 主要仪器设备

2．1．6 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．2 CA19-9室内参考品稳定性评价

2．2．3 CA19-9单克隆抗体的制备

2．2．4 CA19-9荧光免疫层析检测方法的初步建立

2．2．5 检测试纸条优化

2．2．6 荧光定量检测试纸条的性能测定

第三章 结果与分析

3．2 CA19-9单克隆抗体的制备

3．2．1 间接ELISA检测方法的建立

3．2．2 尾血效价检测结果

3．2．3 细胞融合及克隆化筛选结果

3．2．4 细胞株稳定性检测结果

3．2．5 腹水效价检测结果

3．2．6 单克隆抗体腹水收率检测

3．2．7 单克隆抗体纯度鉴定

3．2．8 单克隆抗体亚型鉴定

3．2．9 单克隆抗体特异性鉴定

3．2．10 ELISA法CA19-9单克隆抗体配对结果

3．3．2 最适荧光微球的选择

3．3．3 NC膜的选择

3．3．4 CA19-9标记抗体量、复溶倍数、包被抗体浓度的筛选

3．3．5 包被液的筛选

3．3．6 最适EDC量与活化时间的确定

3．3．7 标记缓冲液pH影响

3．3．8 微球复溶保护液的优化结果

3．3．9 微球结合垫处理液的优化结果

3．4．1 试纸条标准曲线

3．4．2 试纸条最低检出限

3．4．3 试纸条特异性

3．4．4 试纸条精密性

3．4．5 回收实验

3．4．6 试纸条稳定性

3．4．7 方法学比对

第四章 讨论

4．2 CA19-9荧光免疫层析检测方法的建立

4．2 未来工作

第五章 结论

参考文献

致谢

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