基于iTRAQ技术的针刺治疗失眠大鼠脑组织相关蛋白组学分析及效应蛋白验证研究

摘要

目的：　　运用蛋白质组学技术及生物信息学分析方法，筛选并鉴定针刺治疗失眠的特异性差异表达蛋白，探讨失眠及针刺治疗失眠过程可能的调控机制和生物信息途径，筛选出失眠潜在治疗靶点，为临床针刺治疗失眠提供可靠依据。　　方法：　　本研究主要分为三个部分：第一部分，针灸治疗失眠临床疗效的Meta分析；第二部分，基于iTRAQ（同位素标记相对和绝对定量）技术的针刺治疗失眠大鼠脑组织相关蛋白组学分析；第三部分，Western blot验证差异蛋白卷曲螺旋C2结构域蛋白1A（CC2D1A）和PH结构域蛋白5（FGD5）的表达。　　主要方法如下：　　1.通过计算机、人工，对中文期刊全文数据库（CNKI）、维普期刊数据库（维普VIP）、万方全文数据库(CSPD)中关于针灸治疗失眠的临床随机对照试验文献进行检索，筛选符合要求的文献，按照循证医学系统评价方法，使用改良后Jadad评分量表对纳入研究的文献质量进行评价，运用RevMan5.3.5软件进行系统分析。　　2.将50只雄性SD大鼠随机分为5组，分别为空白组、捆绑组、模型组、空白针刺组、模型针刺组。采用对氯苯丙氨酸（PCPA）法制作大鼠失眠模型，并通过戊巴比妥钠睡眠实验对失眠模型进行评价。空白针刺组和模型针刺组大鼠选取五脏背俞穴（“肺俞”、“心俞”、“肝俞”、“脾俞”、“肾俞”）进行针刺干预。运用iTRAQ技术分别对5组混合样品蛋白质进行肽段标记，液相色谱——串联质谱（LC-MS）进行相关蛋白质鉴定，通过生物学分析筛选出失眠及针刺治疗失眠的差异表达蛋白，探讨失眠病理及针刺治疗失眠可能的调控机制和信号传导途径。　　3.运用 Western blot技术对候选差异蛋白CC2D1A、FGD5的表达进行验证。运用BCA法测定5组样品蛋白浓度，通过12%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、化学发光的方法检测两种差异蛋白的表达情况，数据处理用SPSS18.0统计软件，以p＜0.05认为差异具有统计学意义。证明CC2D1A、FGD5确实在针刺治疗失眠的生物学途径中发挥了重要作用。　　结果：　　1.纳入符合要求的文献共10篇，失眠病例共计757例。Meta分析结果显示，针灸疗法与常规西药相比，对睡眠质量的影响方面存在统计学差异，针灸疗法优于常规西药[MD=-1.14,95%CI(-2.05,-0.23), p＜0.05]。针灸与常规西药在治疗失眠的总有效率方面的差异显著，且针灸疗效更好[Z=6.14,OR=5.24,95%CI(3.09,8.89), p＜0.01]。　　2.造模后治疗前，模型组、模型针刺组大鼠的生存状态发生改变，表现为精神萎靡，反应灵敏度下降，攻击性强，进食量减少，饮水量增多，毛发光泽度降低等；与空白组相比，睡眠潜伏期延长、睡眠时间缩短（p＜0.05）。针刺治疗后，与模型组相比，模型针刺组大鼠白天活动减少，精神萎靡状态有所改善，攻击性降低，进食量增多，饮水量有所减少，且空白组、空白针刺组、模型针刺组大鼠体重增加明显（p＜0.05），空白针刺组和模型针刺组大鼠的睡眠潜伏期缩短，睡眠时间延长（p＜0.05）。　　3. iTRAQ标记的5组大鼠脑组织蛋白， LC-MS共鉴定出蛋白质组3383个，得到肽段16641个。按照定量标准Ratio<0.83或Ratio>1.2，空白组-模型组有163个，模型组表达上调73个，下调86个，其中显著差异的蛋白质有金属蛋白酶抑制剂4（TIMP4）、二氢嘧啶酶相关蛋白2（DPYSL2）等；模型针刺组-空白组202个，模型针刺组上调137个，下调64个；模型组-模型针刺组117个，模型针刺组上调82个，下调35个；捆绑组-模型针刺组244个，模型针刺组表达上调88个，下调150个。维恩图分析得到34个差异蛋白，根据功能筛选出4个可能与针刺治疗失眠相关差异蛋白，CC2D1A、类脊髓小脑共济失调蛋白2（ATXN2L）、FGD5、芳香烃受体抑制因子（AhRR）。其中CC2D1A、ATXN2L在模型组表达显著上调，针刺治疗后表达下调；FGD5、AhRR在模型组表达下调或未表达，针刺治疗后表达上调。生物信息学分析提示参与失眠过程的差异蛋白主要具有结合作用、催化作用、酶活性调控作用等；参与的生物过程主要有细胞过程、生物调节、色素形成、代谢过程等。针刺治疗失眠效应的调控蛋白的主要分子功能有催化作用、结合作用、酶活性调控等。主要参与的生物学过程有细胞过程、建立蛋白质定位、转录调控、细胞内信号级联等。　　4. Western blot验证结果显示：与空白组相比，捆绑组CC2D1A的表达水平无统计学意义（p＞0.05），模型组 CC2D1A表达量明显增高（p＜0.01）；与模型组比较，模型针刺组CC2D1A表达水平下调（p＜0.05）；与空白针刺组比较，模型针刺组CC2D1A表达量差异具有统计学意义（p＜0.05）。　　与空白组比较，捆绑组、空白针刺组FGD5表达量的差异没有统计学意义（p＞0.05），模型组 FGD5表达下调（p＜0.05）；与模型组比较，空白针刺组、模型针刺组FGD5表达上调（p＜0.05）；空白针刺组、模型针刺组也有显著差异（p＜0.05）。Western blot的结果与质谱分析结果一致。　　结论　　1.针灸治疗失眠的随机对照试验研究对随机分配方法、失眠评定方法、组间基线等描述较之前更为详细，疗效评定具有多方位性。针灸治疗失眠的临床疗效显著，在改善睡眠质量和总有效率方面均优于常规西药。　　2.针刺治疗可改善失眠大鼠的生存状态，增加失眠大鼠体重，缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间。　　3.失眠过程中的差异蛋白主要功能涉及结合作用、催化作用和酶活性调控作用等。细胞过程、生物调节和代谢过程是参与失眠生理病理的主要生物过程，主要的差异蛋白有TIMP4、DPYSL2等。　　4.针刺治疗失眠效应的蛋白主要参与细胞过程、建立蛋白质定位、转录调控、细胞内信号级联等过程。针刺通过下调CC2D1A、ATXN2L表达水平，上调FGD5、AhRR表达水平发挥生物学效应。　　5. iTRAQ技术能够用于研究针灸治疗疾病的生物学过程，揭示这一复杂过程中的分子生物基础，有利于推动针灸疗效机制研究的发展。

目录

英文缩略词表

前言

第一部分：针灸治疗失眠临床疗效的Meta分析

资料与方法

结果

第二部分：基于iTRAQ技术的针刺治疗失眠大鼠脑组织相关蛋白组学分析

实验1：针刺对失眠模型大鼠疗效的研究

实验2：针刺治疗失眠大鼠脑组织相关蛋白组学分析

第三部分：Western blot验证差异蛋白CC2D1A和FGD5的表达

材料与方法

结果

理论探讨

1 中医对失眠的认识

2 针灸治疗失眠的疗效分析

3 选用蛋白质组学的依据

4 选用iTRAQ技术的依据

5 选穴依据

6 实验结果分析

结论

致谢

参考文献

附录1 模型组与模型针刺组之间差异表达蛋白表

附录2 空白组与模型针刺组之间差异表达蛋白表

附录3 捆绑组与模型针刺组之间差异表达蛋白表

附录4 文献综述:睡眠及针灸治疗失眠的机制研究进展

附录5 在校期间论文论著和科研情况