两性霉素B冻干脂质体的制备及体内外药剂学行为研究

摘要

目的：两性霉素B(amphotericinB，AMB)是一种治疗深部真菌感染的多烯类抗生素，对绝大多数真性致病性和机会性真菌病有很高的疗效，目前尚无适当的可替代药，仍被喻为治疗真菌感染的“黄金标准”。但临床使用时发现在治疗剂量时会产生比较严重的不良反应，从而使它的应用受到限制。 脂质体(liposomes)是一种类似于生物膜结构的双分子层微囊。常规脂质体由磷脂和胆固醇组成的，含有脂质双层，内囊泡为水相。现脂质体技术已发展为一种定向的给药系统，可以作为各类治疗药剂的人工膜和赋形剂。这种微粒具有类细胞结构属于靶向给药系统的一种新剂型，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺等组织器官中积蓄，并优先聚集在感染炎症等部位，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。因此，基于以上考虑，本研究采用两性霉素B为模型药物，制备两性霉素B冻干脂质体，以使所输送药物定向释放、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性、使所包裹药物长效化等。 方法：在文献和预实验的基础上初步确定两性霉素B冻干脂质体的制备方法和处方，通过单因素考察初步确定影响脂质体制备因素。对两性霉素B冻干脂质体的制备方法进行研究。采用薄膜分散法、主动载药法、乙醚注入法、逆相蒸发法四种方法制备脂质体，利用葡聚糖凝胶柱对脂质体与游离药物进行分离，测定脂质体两性霉素B的包封率。确定了薄膜分散法为两性霉素B冻干脂质体的制备方法。 以包封率和冻干复溶前后脂质体外观、粒径分布和稳定性等为指标，通过单因素考察优化脂质体的制备工艺，并考察类脂材料用量、磷脂胆固醇比例、药物用量和冻干保护剂等对脂质体的影响。在此基础上，采用四因素三水平正交试验设计对各种辅料用量进行筛选，并对评分结果进行分析最后确定脂质体的最佳处方。 分别绘制两性霉素B脂质体和两性霉素B溶液的体外释放曲线比较其体外释药过程，并用零级、一级、Higuchi和Weibull方程进行拟合，考察相关系数。 以粒径，外观，颜色，氧化指数作为指标，考察了两性霉素B脂质体的物理和化学稳定性。 选用大鼠和小鼠作为动物模型，采用高效液相法分别对两性霉素B溶液和脂质体进行药物动力学及小鼠体内分布情况测定。液相条件：色谱柱：DiamonsiLTM ODS C18(钻石)250×460mm，5μm；预柱：YWG2 C18 10mm×4.6mm；以乙腈：EDTA-2Na水(0.005mol/L)40:60(PH5.0)为流动相；检测波长：385nm；柱温：37℃；流速：1ml/min。用矩量法进行药代动力学参数处理，计算各种药动学参数。考察两性霉素B脂质体在大鼠体内的药物动力学和小鼠体内分布，并进行了靶向性评价。 结果：薄膜分散法所制备的脂质体包封率较高，采用正交设计，最佳处方为磷脂450mg，胆固醇150mg，药液浓度为3.33mg/ml，蔗糖和甘露醇分别为90mg、150mg。所制备薄膜分散法脂质体平均包封率为74.3％，平均粒径为173.5nm，在光镜和透射电镜下呈类圆形，pH值为6.75，粒径大小符合靶向要求。 两性霉素B脂质体和两性霉素B溶液的体外释放曲线，分别用零级、一级、Higuchi和Weibull方程进行拟合，考察相关系数。两性霉素B脂质体和溶液体外释药均符合Weibull方程，分别为ln[-ln(1-Q)]=1.395lnt-4.146，ln[-ln(1-Q)]：0.6352lnt-3.091，相关系数分别为r=0.9953和r=0.9911。T50为14.82h和3.96h，Td为22.02h和5.17h。由此可知，两性霉素B脂质体较两性霉素B水溶液具有缓释作用。 稳定性结果显示：在4℃条件下避光贮存1个月，冻干脂质体外观饱满，呈疏松粉状。复水性良好，形成均匀混悬液。包封率略有下降，粒径变化不大，稳定性较好，说明脂质体需在冷藏避光条件下保存。 药动学实验表明：两性霉素B溶液和两性霉素B脂质体静脉给药后，脂质体组与溶液组相比，在大鼠体内的消除半衰期延长，t1/2从6.11h延长至8.25h，AUC显著增高，清除率降低，可显著延长药物在体内的存留时间，从而延长药物到达组织的时间，可显著提高药物疗效。 小鼠体内分布实验表明，两性霉素B脂质体较两性霉素B溶液对肝脾和肺靶向性显著提高。溶液组中肝和脾Te分别为0.92和0.32，而脂质体组中Te分别为6.53和6.49，证明了两性霉素B脂质体对肝和脾有靶向作用，达到了设计要求。结论：以两性霉素B为模型药物，以卵磷脂、胆固醇和冻干保护剂为主要材料，采用薄膜分散法制备的冻干脂质体，其制备工艺简单，质量可控。根据药物药理作用特点设计以肝脾和肺为靶点，作为靶向给药的新剂型具有良好的开发前景。

目录

声明

摘要

第一部分两性霉素B冻干脂质体的制备

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分两性霉素B冻干脂质体的质量评价及体外释放考察

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分两性霉素B冻干脂质体药动学及体内分布研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 脂质体载药系统的研究进展

致谢

个人简历