焦炉逸散物有机提取物对支气管上皮细胞损伤的实验研究

摘要

目的：焦炉逸散物（coke oven emission，COE）是在焦化生产过程中释放的主要环境污染物，除颗粒物外，具有多种致突变和致癌性的多环芳烃。长期暴露于COE容易引发机体产生慢性炎症和肿瘤，而炎症又可以促进肿瘤细胞的转化、生长和转移。本研究应用不同染毒剂量的焦炉逸散物有机提取物作用于16HBE细胞建立24h和5d细胞染毒模型。初步探讨焦炉逸散物有机提取物对支气管上皮细胞的损伤情况。为后续COE暴露人群的效应性生物标志物分析提供依据和线索。　　方法：1 COE有机提取物作用于16HBE细胞建立24h染毒模型：将人支气管上皮细胞系16HBE接种在含有10％的胎牛血清的MEM培养基中，在37℃和5% CO2的条件下传代培养。当细胞融合率达70%时用不同浓度的焦炉逸散物有机提取物处理24h，作用浓度依次为5mg/L、10mg/L、20mg/L，胎牛血清浓度为5%。同时设置0.1%DMSO的COE溶剂对照，每个剂量组均设置平行样。2 COE有机提取物作用于16HBE细胞5d染毒模型建立：细胞培养条件、染毒物质的剂量与24h模型相同，连续染毒5d，每次更换新的含COE有机提取物的培养基，每个剂量组均设立平行样。3应用MTT和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估COE对16HBE细胞的细胞毒性。4应用流式细胞仪检测16HBE细胞内活性氧（ROS）的释放水平。5应用彗星实验检测16HBE细胞的DNA损伤情况。6应用悬液芯片 Human Th17 Cytokine Panel15-Plex检测上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、可溶性细胞表面分化抗原40配体（sCD40L）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达情况。7应用蛋白免疫印迹方法检测IκBα、P-IκBα、P65和P-P65蛋白表达水平。　　结果：120mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后，细胞存活率为89.38%（P＜0.05），LDH释放量为147.68%（P＜0.05）。10 mg/L和20 mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后，LDH释放量分别为124.39%和149.64%（P＜0.01）。说明 COE有机提取物可以损伤16HBE细胞，染毒周期增加，毒性亦增加。2 COE有机提取物无论24h染毒还是5d染毒均能检测到活性氧的释放，随着染毒剂量的增加而逐渐升高（P＜0.01）。在24h染毒的模型中，5mg/L低剂量组的细胞平均荧光强度相较对照组增加的倍数值比在5d模型中低。在24h模型中增加的倍数是14.47倍，5d模型中为17.85倍。3单细胞凝胶电泳结果显示，细胞出现DNA损伤。20mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后，尾部DNA百分含量增加83.51%（P＜0.01），Olive尾距指标增加76.47%（P＜0.05）。20mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后，尾部DNA百分含量与对照组相比较增加89.28%（P＜0.01），Olive尾距指标值增加量为照组的117.07%（P＜0.01）。4 COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后，IL-10的表达量分别是1.25±0.54、1.39±0.13和（1.90±0.73） pg/mL，具有良好的剂量-效应关系（r=0.98，P＜0.05）。IL-23仅在该模型的中、高剂量组表达。COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后，IL-10在各剂量组的表达量依次为1.71±0.02、1.49±0.13和（2.82±0.16） pg/mL。IL-1β仅在该模型中表达。表明 COE有机提取物影响16HBE细胞炎性因子的表达。5 COE有机提取物染毒24h对16HBE细胞中NF-κB通路蛋白表达的影响：IκBα蛋白表达量呈现下降趋势，在5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L COE组下降量分别为对照组的26%、33%和56%（P＜0.05）。P-IκBα蛋白表达量在中、高剂量组上升显著，在10mg/L COE组中的增加量为对照组的79%（P＜0.05），在20 mg/L COE组的表达量是对照组的2.02倍（P＜0.05）。P-P65在10 mg/L COE组的表达量为对照组的3.84倍（P＜0.05），在20 mg/L COE处理组，其表达量为对照组的6.43倍（P＜0.05）。P65蛋白表达量无明显变化。　　结论：1、IL-23和IL-1β分别反映焦炉逸散物染毒24h和5d的炎性损伤，IL-10可以反映焦炉逸散物有机提取物染毒16HBE细胞24h和5d的炎性损伤。2、炎性和免疫损伤可能是焦炉逸散物致癌的早期效应改变。3焦炉逸散物有机提取物致16HBE细胞损伤与NF-κB信号活化有关。

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引言

第1章 实验研究

1.1 材料与方法

1.1.1 主要仪器与试剂

1.1.2 实验方法

1.1.3 统计学分析

1.2 结果

1.2.1 COE有机提取物对16HBE细胞的细胞毒性影响

1.2.2 COE有机提取物对16HBE细胞ROS释放的影响

1.2.3 COE有机提取物对16HBE细胞DNA损伤的影响

1.2.4 COE有机提取物对16HBE细胞细胞因子表达的影响

1.2.5 COE有机提取物对16HBE细胞NF-κB通路蛋白表达的影响

1.3 讨论

1.3.1 焦炉逸散物染毒引起支气管上皮细胞DNA损伤

1.3.2 焦炉逸散物染毒致支气管上皮细胞炎症反应

1.3.3 焦炉逸散物染毒对支气管上皮细胞炎性相关蛋白表达的影响

1.4 小结

参考文献

第2章 综述:焦炉逸散物致机体呼吸系统损伤的研究现状

2.1 焦炉逸散物的成分

2.2 焦炉逸散物对呼吸系统的影响

2.2.1 焦炉逸散物的致癌作用

2.2.2 焦炉逸散物对肺功能的影响

2.2.3 焦炉逸散物诱导的肺部疾病

2.3 焦炉逸散物致损伤效应的生物标志物

2.4 焦炉逸散物致呼吸系统疾病的预防

参考文献

结论

致谢

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