康莱特联合非替尼对肺癌A549细胞P-Akt、C-Met表达的影响及机制研究

摘要

目的:非小细胞肺癌(NSCLC)是当代世界常见恶性肿瘤之一，已居多数国家癌症死亡原因的首位。近些年来新的分子靶向药物表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的出现为NSCLC的治疗带来了曙光。吉非替尼是一种口服的有活性、选择性的EGFR-TKIs，目前已成为肺癌分子靶向治疗中较为成熟的药物。临床研究已表明，吉非替尼单药治疗各种类型NSCLC的总有效率仅为10％～20％，因此人们希望与其他药物联合应用以进一步提高抗肿瘤效应。康莱特注射液是一种中药制剂，由中药薏苡仁中提取出的薏苡仁油制成，研究表明其对多种肿瘤细胞均能有较强的杀伤及抑制作用。一些小样本临床研究发现，康莱特联合化疗能显著提高晚期NSCLC的治疗效果。目前已有许多研究证明PI3K/Akt信号通路在NSCLC的发生、发展中起重要作用。约有50％-70％的NSCLC中存在Akt的磷酸化即p-Akt，这表明PI3K/Akt信号通路的激活在NSCLC中很常见。c-Met蛋白是一种由原癌基因c-Met编码、具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体，可与肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)特异性结合，激活下游一系列信号转导通路，调控细胞的增殖、活力、迁移、血管形成、侵袭以及形态发生等。c-Met信号的改变能促进肿瘤的发生和发展。有研究结果显示在NSCLC中非靶受体c-Met继发性过表达与吉非替尼的继发性耐药有关。本实验应用一系列实验方法，通过检测药物处理后的人肺腺癌A549细胞株中细胞凋亡率、p-Akt及c-Met的mRNA及蛋白等的表达来探索吉非替尼联合康莱特对A549细胞株的作用及其机制。　　 方法:　　 1、体外培养肺腺癌A549细胞，选取对数生长期细胞进行实验。实验分为空白对照组，吉非替尼组，康莱特组，吉非替尼联合康莱特组;吉非替尼组设置浓度梯度为:0.1、0.5、1、5、10、20、40μmol/L，作用时间:24h、48h、72h;康莱特设置浓度梯度为:5、10、20、40、80、100、160μl/ml，作用时间:24h、48h、72h;联合用药组:根据康莱特抑制率求IC50，吉非替尼选择本实验中最高作用浓度;应用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay，MTT)法分别测定各药物不同浓度、不同作用时间的抑制率。　　 2、根据MTT结果，康莱特IC50=80μl/ml，故联合用药组康莱特取80μl/ml，吉非替尼选择本实验中最高作用浓度40μmol/L，共同处理48h后，应用流式细胞学检测各处理组中对细胞生长的抑制情况。　　 3、选取对数生长期细胞置入六孔板培养，组别设置同上。倒置显微镜下观察细胞形态学变化。采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）染色法检测各组药物处理后细胞内p-Akt、c-Met蛋白含量的变化。　　 4、取对数生长期细胞，组别设置同上。药物作用48h后提取RNA，检测总RNA的量、纯度及完整性，通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)半定量检测药物处理后细胞内c-Met mRNA的表达水平。　　 5、实验数据经SPSS18.0统计处理，采用正态性检验，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异非常显著。　　 结果:　　 1、MTT结果显示:　　 1.1、与对照组相比，随着康莱特浓度及作用时间的增加，对A549细胞的抑制率逐渐升高，其抑制作用有剂量效应及时间效应依赖关系;　　 1.2、联合用药组:康莱特联合吉非替尼培养48h后，两药联合作用抑制率高于各单药组，有统计学意义(P＜0.05);　　 1.3、与对照组相比，吉非替尼组对A549细胞有一定程度的抑制作用，但作用并不明显。　　 2、流式细胞学结果显示:　　 2.1、作用于细胞48h后，各单药组及联合用药组细胞凋亡率均显著增加;　　 2.2、联合组的细胞凋亡率高于单药康莱特组、单药吉非替尼组，有显著性差异（P＜0.05）;　　 3、免疫组织化学检测结果显示:　　 与对照组相比，康莱特组作用于A549细胞48h后，均能下调p-Akt、c-Met蛋白表达阳性率，P＜0.05;吉非替尼组作用不明显，P＞0.05;联合用药组较吉非替尼组显著下调p-Akt、c-Met蛋白表达，P＜0.05。　　 4、RT-PCR结果显示:　　 4.1、康莱特组c-Met mRNA表达水平较对照组下调，吉非替尼组则无明显作用;　　 4.2、两药联合组c-Met mRNA表达水平较对照组及吉非替尼组均下调明显。　　 结论:　　 1、康莱特对人肺腺癌A549细胞株的抑制率在一定范围内随着药物浓度、作用时间的增加而增加，并呈剂量-时间依赖性;康莱特联合吉非替尼作用于A549细胞株48h的抑制率高于各单药处理组;根据金氏公式计算q值，表明两药联合可能具有一定的协同增效作用。　　 2、康莱特组、吉非替尼组作用48h后可诱导肿瘤细胞凋亡，;联合组凋亡率高于对照组、单药康莱特组、单药吉非替尼组(P＜0.05)。　　 3、康莱特联合吉非替尼组在转录水平及蛋白水平下调p-Akt、c-Met较单药康莱特组明显，推测康莱特可能从PI3K/Akt信号通路发挥抗肿瘤作用，并可能改善吉非替尼的耐药作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 细胞培养基药物制备

3 试验分组

4 MTT法检测细胞增殖

5 流式细胞学检测药物对A549细胞对凋亡的影响

6 免疫组织化学方法检测药物干预48h后对细胞内p-Akt蛋白、c-Met蛋白表达的影响

7 逆转录PCR(RT-PCR)检测A549细胞经药物处理48h后细胞内c-Met mRNA的表达

8 统计学处理

结果

1 倒置显微镜观察A549细胞形态学变化

2 各组对A549细胞增殖的抑制作用

3 各组对A549细胞凋亡率的影响

4 各组对A549细胞株P-Akt蛋白、c-Met蛋白表达的影响

5 RT-PCR检测各组c-Met mRNA表达

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历