哺乳动物粪便DNA提取技术研究

摘要

以粪便为材料提取动物DNA进行保护遗传学和分子生态学研究的关键是能否提取到高质量的粪便DNA。自粪便DNA分析技术兴起后，国内外在这方面做出了巨大的成就，发展了多种粪便DNA提取方法，充分证实了粪便DNA分析的可行性。但仍存在以下问题：①各种提取方法通用性不好。在许多实验中存在扩增成功率在物种和个体之间的差异。这一直是阻碍粪便DNA提取技术推广的主要障碍。虽然专用粪便DNA提取试剂盒有着较好的通用性，但昂贵的价格限制了该试剂盒的广泛应用，因此构建一套效果好、通用性好、性价比高的粪便DNA提取方法，可以大大推进粪便DNA技术的推广。②对陈旧粪便DNA提取的研究还是空白。本文所指的陈旧粪便是保存超过2年以上的粪便样品。从陈旧粪便中提取DNA对于充分利用迁出或死亡动物的遗传信息，扩大分子粪便学技术的应用范围具有十分重要的作用。③对粪便最佳保存方法的摸索。保存方法合适与否对粪便DNA质量影响很大，有许多学者对各种保存方法的保存效果进行了比较研究，但结果并不一致甚至相互抵触，这种矛盾影响了研究者对保存方法的选择。间接地阻碍了粪便DNA技术的发展。④未考虑到与DNA提取相关环节对结果的影响。由于粪便材料的特殊性，它的提取结果受到多重因素的影响，如样品的采集、保存等等，忽视其中任何一个环节，都会给试验结果带来不利影响甚至导致试验失败。 本文以11种哺乳动物粪便为材料，分别构建了2种新的提取方法解决了问题①和②；以粪便DNA提取产物的浓度和纯度为指标，用正交分析对问题③和④进行了分析，主要结果如下： 1、本论文中构建的改进型CTAB提取方法广泛适用于各食性哺乳动物粪便DNA提取，成功率高，一般不需重复提取。我们总计对11种动物粪便进行了DNA提取验证，仅一次提取即得到高质量的模板DNA，对PCR产物的测序结果也证实了方法的可靠性和通用性。虽然德国QIAGEN公司的粪便DNA提取专用试剂盒QIAampDNAStoolKit也有着较好的通用性，但其昂贵的价格(50元/次)使其在大量分析样品时受到很大的限制。与之相比，本方法成本低廉，每提取一个样品的成本低于3元，用实验室常用试剂即可完成粪便DNA提取，同时产物纯度高于专用试剂盒。即拥有超过专业试剂盒提取效果，又尽可能的降低了实验成本，真正实现了实验室通用性，有利于粪便DNA技术的迅速推广。 2、在对陈旧粪便DNA提取研究中，通过多管收集—预处理—有机溶剂抽提的方法，从无水乙醇常温保存3～4.5年的陈旧粪便中提取到DNA并成功的进行了PCR扩增和测序，实验效果大大优于其他方法。它证明了陈旧粪便DNA提取及应用的可行性，解决了因动物的迁出或死亡而无法再获得这些动物的分子遗传信息的困难，拓宽了粪便DNA分析技术的应用范围。 3、通过正交实验对粪便DNA的纯度和浓度分别进行分析，得出以下结论：保存方法、样品与保存物质比例和保存温度三个因素对粪便DNA提取产物的浓度有显著影响，但对产物的纯度影响不大；保存时间并非影响粪便DNA质量的主要因素，因此若保存策略(前三个因素)正确，粪便样品应可以有效保存很长时间。本实验得出的最佳保存策略为：用8倍于粪便样品体积(1mg粪便样品换算为1μl保存液)的DETs浸泡样品并置于-70℃保存。 4、取样方法在粪便DNA提取中非常重要，它对粪便DNA产物浓度和纯度均有显著影响。在取样方法合适的情况下，提取方法将决定产物的纯度，而暴露时间和预处理影响产物浓度。最佳的提取流程为：尽量减少粪便在野外暴露时间、DETs冷冻保存、采样外部取样、PBS预处理、改进型CTAB法提取粪便DNA，而粪便在野外暴露的时间则应越短越好。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及学位论文版权使用授权书

符号说明

第一章前言

第二章高纯度粪便DNA提取通用方案的建立

第三章陈旧粪便DNA提取方法体系的建立

第四章对粪便保存方法的研究

第五章对影响粪便DNA提取的相关因素的探讨

第六章总结

参考文献

致谢

作者简介

附件