CTGF和bFGF在风湿性心脏病合并房颤患者心肌纤维化发展过程中的意义

摘要

心房颤动(atrial fibrillation，AF)在临床心律失常的类型中非常普遍，其临床表现存在于诸多疾病中，不但致死率及致病率高而且并发症严重比如心功能不全及血栓栓塞等，至今其发生机制尚且不明。当前，多方研究证实心房离子通道及架构重塑存在于房颤始末全程而房颤患者心房架构重塑过程中最显著的改变是心房纤维化。非心肌细胞占据了心肌细胞种类的绝大多数并且其中心肌成纤维细胞占据总数的90％以上，纠其主导影响是心肌成纤维细胞能够合成包括胶原蛋白在内的多种细胞外基质。房室中ECM分别大概占心肌组织总体积49％和17％，ECM的主要组成部分是胶原而胶原纤维又可以推测估计器官纤维化是否严重，五种胶原亚型组成上述胶原纤维其中心肌胶原总数约85％是Ⅰ型胶原，心肌胶原总数约11％是Ⅲ型胶原。在平衡心肌组织正常构造和心脏功能整体统一领域Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原比值起到了不可或缺的意义。细胞因子，尤其要指出的是碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在纤维化性疾病的出现和形成过程中扮演非常重要角色，影响深远。研究证明持续性房颤患者肺静脉周围存在严重的间质纤维化的存在可能与CTGF在肺静脉的表达水平升高有关但心房纤维化的具体机制尚未完全明确。CTGF和bFGF在房颤患者心房肌中的表达及如何参与心房纤维化过程的报道在国内外研究中较少。本论文共分两个步骤:第一步研究讨论风心病房颤患者心房组织胶原结构改变;第二部分探讨细胞因子CTGF和bFGF与房颤心房纤维化的关系。选取ELISA、免疫组化法、半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(western-blot法)等实验操作，通过实验检测风湿性心脏病不同类型房颤患者血清中CTGF、bFGF的水平变化和心房组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、bFGF、CTGF等的表达和定位及其基因转录水平、蛋白质表达水平的差异等，进一步研究归纳结论它们在心房纤维化形成和扩增过程中的相关性等。为之后涉及风心房颤患者的心房肌纤维化机制的进一步研究贡献实验根据并在房颤的预先防患和新靶点的发现方面起到关键紧要的理论和临床指导意义。　　目的：　　1、检验推测风心房颤患者心房架构中胶原含量及分布来归纳总结房颤心房纤维化的演变情况，从而证实组织架构重塑发生于心房纤维化是房颤形成和进展过程中的紧要环节。　　2、通过检测细胞因子CTGF和bFGF在各型风心房颤患者血清水平变化及CTGF和bFGF在心房组织内的mRNA和蛋白表达程度的差异性，进而探讨并总结细胞因子CTGF和bFGF在心房颤动患者心房纤维化中的作用并在以后寻找新的靶点完善房颤的预防及治疗方面提供详细的实验依据。　　方法：　　1、通过收集风湿性心脏病（风心病）患者临床资料及开胸手术时心房组织标本，分为窦性心律组、风心病房颤组，以窦性心律组患者心房组织为对照，区别方式采用Masson染色法、羟脯氨酸法、RT-PCR法检测心房胶原分布、心房胶原含量、心房Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达变化。　　2、区别方法采用ELISA法、免疫组化法、RT-PCR法、western-blot法检测各组患者血清CTGF和bFGF程度差异性、心房中CTGF和bFGF表达及分布情况、心房中CTGF和bFGF mRNA的表达、心房中CTGF和bFGF蛋白水平的表达变化。　　结果：　　1、收集有效病例54例，其中18例在风心病窦性心律组34例在风心病房颤组，临床资料表明窦性心律组左房内径(LAd)非常鲜明的小于房颤组(P＜0.05)，两组年龄、性别、左室射血分数(LVEF)及瓣膜病变等差异无显著性(P＞0.05)。　　2、Masson染色可见胶原分布的蓝染的胶原纤维着重集中在心肌间质并从窦性组到房颤组阳性反应稳健增强。胶原含量检测及胶原染色图象半定量分析显现风心病房颤组胶原含量相对窦性心律组有显明差异性，房颤组均显著增加(P＜0.01);　　3、RT-PCR法结果表显示心房内Ⅰ型和Ⅱ型胶原mRNA在两个实验组中表达量逐渐增加。其中比较两组Ⅰ型胶原mRNA的表达量有显明差异性(P＜0.05)，但比较Ⅲ型胶原时无显明差异性(P＞0.05)。　　4、两组血清CTGF程度逐步增长，两组比较差异性明显(P＜0.05);CTGF主要表达心房心肌细胞胞浆及细胞核并呈棕色颗粒状。通过免疫组化检测、mRNA表达及蛋白水平检测后CTGF在窦性组和房颤组心房组织中比较逐渐增加，有显著差异性(P＜0.05)。　　5、两组血清bFGF密集程度渐进增多，两组数据相比有显明差异性(P＜0.05);bFGF广泛分布并以棕色细颗粒状主要积聚于心房肌胞浆及通过免疫组化检测、mRNA表达及蛋白水平检测并比较bFGF在窦性组和房颤组心房组织中逐渐增加，有显著差异性(P＜0.05）。　　6.CTGF及bFGF mRNA水平与Ⅰ型胶原的mRNA行相关性分析显示，房颤组与Ⅰ型胶原成正相关而窦性心律组与Ⅰ型胶原无相关性。　　结论：　　1、心房组织胶原分布于风心病窦性心律组及风心病房颤组密集程度逐步增强，尤其是Ⅰ型胶原，推断阐明房颤的发生和维持与心房纤维化胶原代谢有关，房颤发生发展过程中组织结构重构起到重要的作用，主要体现在心房纤维化上。　　2、细胞因子CTGF、bFGF或许参与心房纤维化胶原代谢，紧密影响房颤形成和发展，或可视为一种房颤抗纤维化治疗靶点。

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摘要

第一部分 风心病房颤患者心房组织胶原结构改变

前言

资料与方法

四、结果

五、讨论

参考文献

第二部分 房颤心房纤维化组织中细胞因子CTGF和bFGF基因表达的变化

前言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

全文研究总结

综述

致谢

研究生在读期间发表论文情况