夜香树提取物Nocturnoside B抗人白血病的实验研究

摘要

目的:探讨夜香树提取物Nocturnoside B在体内体外对人白血病K562细胞的作用，并探讨其可能的机制。　　方法:（1）用MTT检测不同浓度的Nocturnoside B对人白血病K562细胞的增殖抑制作用，并观察细胞形态学改变。（2）应用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，用Annexin V/PI双标记法、TUNEL法检测细胞的早期凋亡变化。（3）通过检测细胞中 Caspase-3酶活性、蛋白质印迹法（Western Blotting）检测凋亡蛋白Caspase-3、细胞质和线粒体内细胞色素C表达，以及DNA琼脂糖凝胶电泳分析法检测DNA图谱的变化来阐述 Nocturnoside B体外诱导 K562细胞凋亡的分子机制。（4）对Nocturnoside B进行急性毒性实验，确定其LD50，为进行下一步研究奠定基础。（5）通过尾静脉注射 K562细胞的方法建立 SCID小鼠人白血病模型，采用外周血细胞分类计数法，化学免疫学病理检查以及骨髓涂片细胞形态检测等方法确定 Nocturnoside B在体内对人白血病 K562细胞动物模型的作用。（6）通过 FCM检测CD13表达率以及Western blotting检测脾脏组织中PI3K、AKT及PTEN蛋白的表达情况来阐述Nocturnoside B对人白血病K562细胞动物模型作用的可能机制。　　结果:（1）Nocturnoside B对K562细胞生长具有显著的抑制作用，并呈剂量-时间依赖性。（2）Nocturnoside B可诱导 K562细胞凋亡，经Nocturnoside B处理后的K562细胞Annexin V+/P-细胞显著增加，在荧光下可观察到TUNEL细胞涂片有明显的荧光效应。（3）经Nocturnoside B处理后的 K562细胞 DNA电泳呈梯形条带，并且可以活化细胞中Caspase-3酶活性以及促进线粒体细胞色C的释放。（4）Nocturnoside B的LD50=31.02 mg/kg，表明其有一定的毒性。（5）成功建立SCID人白血病动物模型后，经Nocturnoside B治疗后，与对照组比较，Nocturnoside B组白细胞总数和CD13阳性表达率明显下降，高剂量组的白细胞总数和CD13阳性表达率明显下降（P＜0.05）；Western Blotting检测结果亦显示， Nocturnoside B治疗组和CY组的PI3K蛋白的表达水平下调，而AKT、PTEN蛋白的表达水平则明显高于阴性对照组；与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。　　结论:（1）Nocturnoside B在体外能有效抑制K562细胞的增殖，并且可以活化细胞中Caspase-3酶活性以及促进线粒体细胞色素C的释放，损伤其 DNA从而诱导K562细胞凋亡。（2）Nocturnoside B可以抑制人移植性白血病动物模型的白血病细胞增殖，下调其 CD13阳性表达率。（3） Nocturnoside B能诱导K562细胞凋亡可能与Nocturnoside B损伤线粒体，促进Caspase-3酶活化从而增强Caspase-3剪切procaspase9的活性，使得Caspase-3酶以及Caspase-9酶的活性增加有关。Nocturnoside B在体内对髓系白血病有一定的抑制作用，其机制可能是通过活化 PTEN活性阻碍PI3K/Akt信号通路的形成，导致Caspase-9的活性增强从而抑制白血病细胞的增殖而达到治疗髓系白血病。

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第一部分Nocturnoside B对人白血病K562细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应的研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分Nocturnoside B体外诱导人白血病K562细胞凋亡的分子机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分 Nocturnoside B对人移植性白血病K562细胞动物模型的作用研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四部分Nocturnoside B对人白血病K562细胞动物模型作用的机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

展望

总结

参考文献

综述

致谢

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