复方中药抗肿瘤作用及其对鼻咽癌细胞微小RNA影响的研究

摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，近半个世纪以来，其发病率和死亡率逐年上升。癌症患者中约70﹪～80﹪是中晚期，多数病人失去早期手术根治的机会，多以放疗或化疗为主，虽有一定的近期疗效，但常因不良反应严重等而未能明显延长患者的生存期<'[1]>。 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)又称“广东癌”，是一种好发于东南亚特别是中国南方地区，来源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤。鼻咽部位复杂的解剖特点决定了实施手术的极大危险性，目前临床上NPC首选的疗法放疗虽几经改良或与化疗等联合应用，但因其非特异毒性、放疗耐受和远处转移等弊端严重制约NPC病人五年生存率的提高<'[2，3]>。 近年来，随着医学科学的发展，肿瘤的临床与基础研究取得了可喜的成就，特别是“综合治疗”理念的提出，为肿瘤临床治疗提供了更广阔的空间。尤其是近年来中医药治疗恶性肿瘤的优势备受国内外关注，已有实验和临床资料表明，中医药在提高肿瘤病人生活质量，延长生存时间，降低肿瘤复发和转移等方面具有独特的优势<'[4]>。因此，开发新的抗癌中药和利用现代技术深入研究具有多种成分、多个作用靶点的中药抗肿瘤作用机制具有重大意义和潜在性应用前景。 复方中药(Fu-Fang-Zhong-Yao，FFZY)是中山大学附属第一医院中医科的经验配方，在临床应用中显示较好的抗肿瘤和改善病人生存状态功效。但其抗肿瘤作用及其机制系统研究尚未见报道。因此，本研究采用体内外实验，按照抗肿瘤药物药效学研究指导原则，观察FFZY对S<,180>和CNE-2荷瘤鼠肿瘤模型等的抗肿瘤作用，并从FFZY对癌细胞周期及凋亡和免疫功能的影响，特别是调控微小RNA(microRNA，miRNA)表达的角度探讨其机制，旨在为FFZY的临床应用提供实验依据。研究材料和方法： 1 主要实验材料：FFZY按配方由广州中医药大学专业人员熬制，每毫升含1克生药的含挥发油浸膏，置于4℃冰箱保存备用；S<,180>、CNE-1及CNE-2细胞株和实验动物购于中山大学实验动物中心； 2 FFZY抗肿瘤作用的体外研究方法： (1)急性毒性试验：观察1g生药/mL FFZY浸膏对昆明小鼠的急性不良反应，评价FFZY的安全性和确定抗肿瘤试验的剂量范围； (2)光镜下细胞形态学观察：体外培养的CNE-1和CNE-2细胞，经浓度分别为10、5、2.5和1.25(mg/mL)的FFZY处理24 h或48 h，光镜下观察细胞形态学变化； (3)MTT法、SRB法和克隆形成实验：检测FFZY对CNE-1和CNE-2细胞活性和增殖能力的影响，以反映FFZY的体外抗肿瘤活性； 3 FFZY抗肿瘤作用的体内研究方法： 选用S<,180>昆明小鼠肿瘤模型和人低分化NPC细胞CNE-2的裸鼠移植瘤模型，评定FFZY对CNE-2细胞成瘤性的影响及对S<,180>和CNE-2荷瘤鼠移植瘤的治疗效果； 4 FFZY抗肿瘤作用的机制探讨方法： (1)流式细胞术和电镜检测：流式细胞术检测不同剂量FFZY对CNE-2细胞周期分布的影响；电镜观察经FFZY治疗的S<,180>荷瘤鼠瘤块S<,180>细胞凋亡及脾和胸腺淋巴细胞增殖情况； (2)激酶试验：分别选用浓度为5、2．5、1.25(mg/mL)的FFZY处理CNE-1和CNE-2细胞，检测其对细胞周期素依赖性蛋白激酶2(CDK-2)激酶活性的影响； (3) MicroRNA芯片检测：采用Paraflo microfluidic microRNA芯片，检测激光扫描器收集杂交的图像，经LOWESS滤器规范信号后比较数据，分析FFZY处理前后CNE-2细胞microRNA表达的差异。 研究结果： 1.FFZY体外抗肿瘤作用的研究结果： (1) FFZY的急性毒性：给药30min后小鼠出现轻微活动减少，2小时左右后恢复正常，连续观察7天，小鼠全身状况、摄食、饮水、大小便和体重增长均正常，无动物死亡；7天后处死动物，解剖并肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等重要脏器，未发现异常改变； (2) FFZY影响NPC细胞形态：CNE-1和CNE-2细胞经不同剂量FFZY处理不同时间后，细胞变圆、脱落或出现明显存活细胞数量减少，并且随着FFZY剂量的增加细胞变化越明显； (3) FFZY抑制NPC细胞活性和增殖：MTT和SRB试验结果显示，不同剂量的FFZY对CNE-1和CNE-2细胞活性均有不同程度的抑制作用，且呈剂量依赖性；克隆形成实验结果显示，与对照组相比，随着FFZY剂量的增加，细胞克隆形成数目减少，亦呈剂量依赖性；结果提示FFZY可抑制体外培养的CNE-1和CNE-2细胞活性和增殖； 2 FFZY体内抗肿瘤作用的研究结果： FFZY可抑制CNE-2在裸鼠体内成瘤性，在S<,180>荷瘤小鼠和CNE-2荷瘤裸鼠两种实验动物肿瘤模型中显示较好的体内抑瘤作用； 3 FFZY体内外抗肿瘤作用的机制 (1) FFZY提高荷瘤小鼠免疫功能：高、中及低浓度FFZY用药可提高S<,180>荷瘤小鼠脾和胸腺系数，促进脾和胸腺淋巴细胞增殖，且以高和中浓度治疗组较明显； (2) FFZY阻滞CNE-2细胞周期和诱导S<,180>细胞凋亡：流式细胞术检测发现FFZY引起CNE-2细胞G0/G1期阻滞；电镜检测发现FFZY治疗组S<,180>荷瘤鼠移植瘤组织中肿瘤细胞出现大量细胞凋亡表现； (3) FFZY降低NPC细胞CDK-2激酶活性：激酶试验检测发现当FFZY浓度为5mg/mL时明显降低CNE-1细胞的CDK-2激酶活性，而FFZY浓度为1.25mg/mL时明显降低CNE-2细胞的CDK-2激酶活性； (4) FFZY影响低分化NPC细胞CNE-2的microRNA表达：microRNA表达谱芯片结果显示FFZY处理CNE-2细胞后，在检测的326个microRNA中，有10个microRNA明显上调，1个microRNA明显下调，其中检测量的绝对值在1000以上且两者相差log2(sampleB signal/SampleA signal)>1的microRNA有hsa-miR-513，hsa-miR-498，hsa-miR-210和hsa-miR-602。 结论： 1、FFZY无急性毒性，在体外可抑制高低分化NPC的CNE-1和CNE-2细胞活性和增殖能力； 2、FFZY可抑制CNE-2细胞在裸鼠体内的成瘤性，在S<,180>荷瘤小鼠和CNE-2荷瘤裸鼠移植瘤模型中显示较好的体内抑瘤作用； 3、FFZY抗肿瘤作用机制通过提高荷瘤鼠脾和胸腺系数及促进脾和胸腺淋巴细胞增殖而调节荷瘤鼠免疫功能，诱导荷瘤鼠S<,180>细胞凋亡，使体外培养的CNE-2细胞周期阻滞； 4、FFZY诱导癌细胞凋亡和阻滞细胞周期可能与降低CDK-2激酶活性和参与调控肿瘤细胞microRNA表达有关。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分复方中药抗肿瘤作用的体外研究

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

第二部分复方中药抗肿瘤作用的体内研究

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三部分复方中药抗肿瘤作用的机制探讨

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

小结

附图一

附图二

参考文献

主要英文缩略词

致谢

原创性声明

发表论文1

发表论文2