肠炎沙门菌对四代头孢菌素——头孢吡肟耐药机制的研究

摘要

沙门菌是引起食源性疾病的主要病原之一，具有2600多种血清型，其中，肠炎沙门菌是造成胃肠道感染中排名前三的血清型，但相对于鼠伤寒、德比等优势血清型来讲，其耐药率较低，大多数新型抗生素和临床一线用药都能够对其起到良好的治疗效果。然而近年来，随着抗生素滥用现象的加剧，肠炎沙门菌的耐药谱也在不断拓宽，研究发现，该血清型的菌株已经开始对第四代头孢菌素--头孢吡肟产生耐药性，由于对其耐药特征、耐药性产生及传播的原因尚未知悉，因此我们开展了以下研究。　　本研究对2005年到2014年上海市疾控中心从腹泻病人和食品动物源中分离到的2914株肠炎沙门菌进行了药物敏感性分析，结果显示，共38株（1.30%，38/2914）表现出对头孢吡肟的耐药表型，包括36株人源菌株和2株食品动物源菌株。这些菌株对β内酰胺类药物--头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟和氨苄西林全部耐药，对萘啶酸、磺胺异恶唑、链霉素和复方新诺明的耐药率分别为97.37%、76.32%、63.16%和52.63%，其多重耐药率为100.00%，耐药谱多达19种。　　通过PCR方法对上述38株肠炎沙门菌的β-内酰胺类耐药基因进行检测，结果显示，耐药菌株携带1～5个不等的ESBLs基因，包括blaCTX-M（100.00%，38/38）、blaSHV （65.79%，25/38）、blaTEM（52.63%，20/38）、blaACC（18.42%，7/38）和blaPSE（5.26%， 2/38），其中blaCTX-M是其共有的且以blaCTX-M-55亚型（84.21%，32/38）居多，可见， blaCTX-M-55基因在耐头孢吡肟的肠炎沙门菌中广泛流行。　　将耐药菌和受体菌放在一起共培养，获得了35株接合子，转移效率为92.11%，所有接合子都实现了blaCTX-M基因的水平转移，另外SH12G402还实现了blaCTX-M-3和blaTEM-1基因的共转移，SH12G1079还实现了blaCTX-M-55和blaSHV-1基因的共转移，耐药基因的水平转移使得接合子对头孢类药物的MIC值有4～2048倍的提高，证明以blaCTX-M-55为主的ESBLs基因具有水平传播并介导耐药性产生的能力。　　为了解blaCTX-M基因的特点，我们首先对接合子进行了质粒复制子分型，分别得到IncFrepB（n=20）、IncI1（n=11）、IncFIIA（n=11）、IncFIIB（n=11）、IncN（n=2）、IncL/M（n=1）和IncY（n=1）7种不同的类型，说明携带blaCTX-M基因的质粒丰富多样；然后通过S1-PFGE和Southern-blot试验发现，每个接合子中有1或2个质粒，大小在76.8kb到138.9kb之间，所有接合子都只有一个杂交信号，即blaCTX-M基因都只定位于其中一个质粒上；采用PCR及测序技术对blaCTX-M基因上下游侧翼序列进行分析，共发现9种不同类型的基因环境，其中17株在blaCTX-M基因的上游检测到了插入序列ISEcp1，有1株在下游检测到了插入序列IS903，ISEcp1和IS903都有类似于启动子的作用，能够对耐药基因的高效表达和扩散起到促进作用。　　最后我们通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）试验将38株对头孢吡肟耐药的肠炎沙门菌分为18种不同的PFGE基因型，89.47%（34/38）的菌株同源性大于85%，说明耐药菌株间存在一定克隆传播的关系；另外，同源性为100%的菌株，其blaCTX-M亚型相同，说明菌株的垂直传播对blaCTX-M基因的扩散也起到了促进作用。　　综上所述，blaCTX-M-55基因在对头孢吡肟耐药的肠炎沙门菌中普遍流行，是促使其耐药性产生的重要因素，blaCTX-M-55基因既可以垂直传播也可以在多种耐药质粒和插入序列ISEcp1等可移动元件的介导下水平传播，IncFrepB、IncI1、IncFIIA、IncFIIB型质粒是blaCTX-M-55基因在不同来源沙门菌中传播的主要载体，其较强的扩散能力给四代头孢菌素在临床治疗中的有效性造成了潜在威胁。

目录

第一个书签之前

1 前言

1.1 沙门菌概述

1.1.2 病原学

1.1.3 临床症状

1.1.4 致病机理

1.2 肠炎沙门菌概述

1.2.1 肠炎沙门菌的流行情况

1.2.2 肠炎沙门菌的耐药情况

1.3 头孢菌素概述

1.3.1 头孢菌素的发展

1.3.2 第四代头孢菌素—头孢吡肟

1.3.3 沙门菌对头孢菌素的耐药机制

1.4 本研究的目的、意义及技术路线

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 工程菌株

2.1.3 药敏纸片和用于MIC的抗生素

2.1.5.2 PFGE试剂及配制

2.1.5.3 S1-PFGE试剂

2.1.6 耗材

2.1.7 主要仪器设备

2.1.8 引物

2.2 方法

2.2.1 所有肠炎沙门菌的纸片法药物初筛

2.2.2 琼脂稀释法测定耐头孢吡肟肠炎沙门菌的药物敏感性

2.2.2.1 受试药液的制备及稀释

2.2.2.2 抗性平板的制备

2.2.2.4 MIC测量

2.2.2.5 结果判定

2.2.3 ESBLs基因的检测及鉴定

2.2.4.2 电转化

2.2.5 接合子质粒复制子分型

2.2.6 S1-PFGE

2.2.7 Southern杂交

2.2.7.1 探针的制备

2.2.7.2 凝胶变性

2.2.7.3 DNA的转移

2.2.7.4 固定

2.2.7.5 杂交

2.2.7.6 免疫检测

2.2.8 blaCTX-M基因侧翼序列的测定

2.2.9 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

2.2.9.2 小凝胶块的灌制

2.2.9.3 凝胶块中细胞的裂解

2.2.9.4 洗小胶块

2.2.9.5 小胶块内DNA的限制性酶切

2.2.9.6 灌制电泳胶

2.2.9.7 脉冲场凝胶电泳

2.2.9.8 图像的获取

2.2.9.9 数据分析及画树

3.1 上海市肠炎沙门菌流行病学特征

3.1.1 菌株的分布

3.1.2 菌株的耐药性

3.2 耐头孢吡肟肠炎沙门菌的流行特征

3.2.1 菌株的流行趋势

3.2.2 菌株的来源

3.3 耐头孢吡肟肠炎沙门菌的耐药特征

3.4 ESBLs基因的检测结果

3.5 接合转移试验结果

3.6 接合子质粒复制子类型

3.7 S1-PFGE和Southern杂交结果

3.8 blaCTX-M基因侧翼序列的测定

3.9 脉冲场凝胶电泳（PFGE分型）结果

4 讨论

4.1 上海市肠炎沙门菌的流行特征

4.2 上海市肠炎沙门菌的耐药特征

4.3 对头孢吡肟耐药的肠炎沙门菌的出现及流行

4.4 对头孢吡肟耐药的肠炎沙门菌的耐药特征

4.4.1 药物敏感性

4.4.2 耐药基因的携带情况

4.5 耐头孢吡肟肠炎沙门菌的克隆传播机制

4.6 耐头孢吡肟肠炎沙门菌的水平传播机制

4.6.1 耐药基因的水平转移及影响

4.6.2 质粒复制子类型

4.6.3 S1-PFGE和Southern杂交试验

4.6.4 blaCTX-M的基因环境分析

5 全文总结

致 谢

附录：硕士期间科研成果及获奖情况

参考文献