广东省猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及防控措施

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 也称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) 引起的以妊娠母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道症状和断奶前后仔猪高死亡率为特征的传染病。该病于1987年首先在美国发现，1996年在我国首次被证实存在，由于PRRSV的高变异，于2006年出现了高致病性蓝耳病，给我国养猪业造成了巨大的经济损失（蔡汝健等，2013）。为了更好的控制PRRS的发生，本研究对广东地区PRRS流行情况进行调查，在此基础上分离获得了1株具有经典毒株与变异毒株重组特征的PRRSV毒株GD-KP，并进一步开展了PRRSV毒株GD-KP分子生物信息学、致病性和免疫效果的研究，在此基础上提出了PRRS的综合防控方案。　　本研究收集2011~2015年广东不同区域疑似PRRS病料3080份，用RT-PCR进行PRRSV核酸检测，对PRRS在不同时间和不同地域流行情况进行研究。2011年~2015年5年期间，广东地区PRRSV样品核酸阳性率分别为49.3%、38.3%、34.8%、42.9%和18.8%。其中，粤东地区658份PRRSV核酸阳性率分别为42%、67%、48.1%、51%和11.9%；粤西地区1249份PRRSV核酸阳性率分别为53%、16%、32.2%、36.2%和15.5%。粤中地区537份PRRSV核酸阳性率分别为40%、46%、35.5%、51.6%、15%；粤北地区636份PRRSV核酸阳性率分别为62%、24%、23.2%、29.9%和32.9%。综上，粤东地区的PRRS流行最严重，粤北地区PRRSV检出率最低但呈上升趋势。　　为了进一步研究广东省PRRSV毒株演变规律，对PRRS疑似病料进行病毒分离，经IFA和RT-PCR鉴定，获得14株PRRSV分离株。对获得的14株PRRSV分离株进行Nsp2、ORF5基因核苷酸序列测定，将获得的Nsp2、ORF5基因序列与PRRSV参考毒株的序列比较。结果显示，PRRSV分离株与PRRSV参考毒株可分为4个亚群，14株PRRSV分离株位于其中2个亚群，除了PRRSV GD-KP株，其余13株分离株和PRRSV JAX1属于同一亚群。PRRSV GD-KP、QY2010、QYYZ和美国分离毒株NADC30属于新的亚群。对获得的14株PRRSV分离株与PRRSV参考毒株GP5蛋白中和抗原表位分析，结果表明，与亚群1的39位氨基酸亮氨酸L39（Leu）相比，亚群2、亚群3和亚群4在39位氨基酸分别突变为苯丙氨酸F39（Phe）、异亮氨酸I39（Ile）、丝氨酸S39（Ser）。亚群1、亚群2和亚群3的毒株（包括亚群4的NADC30株）在氨基酸38位为组氨酸H38（His），亚群4的GD-KP、QY2010和QYYZ（2011）毒株突变为酪氨酸Y38（Tyr）。将10株PRRSV代表毒株GP5蛋白抗原位点分析结果表明，与经典毒株（以VR-2332为代表毒株）相比较，变异毒株（以JXA1为代表毒株）在135~140位和180~185位氨基酸多了两个抗原位点，同时在190~198位少了一个抗原位点。PRRSV GD-KP株GP5蛋白既有经典毒株190~198位抗原位点又有变异毒株135~140位抗原位点，表明GD-KP 毒株可能来源于经典毒株和变异毒株的重组。　　为了进一步了解PRRSV GD-KP株分子特征，应用生物信息学方法分析PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白的理化性质、可溶性、信号肽、跨膜区、亲(疏)水性、翻译后修饰位点、二级结构及抗原表位，并通过SWISS-MODEL程序预测GP5蛋白的三维空间结构。结果显示，PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白通过综合β转角、亲水性、柔韧性、表面可能性区域以及B淋巴细胞抗原表位预测等原则找到一个共同区域在于30~40位氨基酸（氨基酸序列为SANGNSSSYSQ）之间，表明此区域为PRRSV GD-KP株GP5蛋白非常重要的抗原位点；糖基化位点预测分析发现GP5蛋白存在多个糖基化位点，分别位于第34~37、44~47和51~54位氨基酸；运用在线软件 SignalP 工具对PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白氨基酸进行信号肽预测，结果显示，其信号肽位于1~31位氨基酸之间；PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白序列上有3个跨膜螺旋序列，分别位于15~34、66~88和103~125位氨基酸，1~14和89~102位氨基酸位于细胞膜外面，35~65和126~200位氨基酸位于细胞膜内。　　为了解分离获得PRRSV GD-KP株的致病特点，开展了GD-KP毒株对仔猪的致病性研究。结果显示，GD-KP株感染60日龄仔猪后，感染仔猪前4 d表现为食欲下降，精神萎靡，第5 d开始采食量和精神状态恢复正常。第11 d扑杀剖检，见肺心叶、肺尖叶中度病变，肺门淋巴结水肿、出血，脾脏轻度肿大，腹股沟淋巴结肿大、出血。组织病理检查见肺泡内存在大量坏死的巨噬细胞，淋巴小结中央坏死。以上结果表明PRRSV GD-KP株对仔猪具有一定的致病性，但不会引起仔猪死亡。　　在PRRS的防控中单一的疫苗难以达到有效防控的目的，为此，本研究采用4种不同的PRRSV疫苗组合，分别为第1组：14日龄同时免疫PRRS弱毒苗和灭活苗、第2组：14日龄免疫PRRS弱毒苗和35日龄免疫灭活苗、第3组：14日龄免疫PRRS弱毒苗和35日龄免疫弱毒苗，第4组：14日龄免疫弱毒苗。通过免疫后抗体滴度、病毒血症和生产参数评估PRRS疫苗对广东新流行毒株PRRSV类GD-KP毒株免疫效果。结果表明，14日龄免疫弱毒疫苗和35日龄免疫灭活疫苗组效果最好。　　最后，通过临床症状、生产指标和实验室检测评估猪群PRRSV的感染状态。针对不同的PRRSV感染状态制定相应的防控方案，并对其方案进行实施、评估。综上提出了 “评估感染状态-制定防控方案并实施-效果评估”的猪繁殖与呼吸综合征的防控方案。

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第1章 前 言

1.1 研究背景

1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述

1.1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学

1.1.3 猪繁殖与呼吸综合征流行病学研究进展

1.1.4 猪繁殖与呼吸综合征诊断的研究进展

1.1.5 猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

1.2 研究的目的和意义

1.3 研究技术路线

第2章 广东省猪繁殖与呼吸综合征流行情况调查

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果

2.3.1 PRRSV RT-PCR的结果

2.3.2 细胞培养和病毒分离

2.3.3 2011~2015年度广东省PRRSV流行特点

2.4 小结

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2方法

3.3 结果

3.3.1病毒的分离

3.3.2 PRRSV ORF5基因的扩增

3.3.3 间接免疫荧光检测（IFA）

3.3.4 病毒滴度测定

3.3.5 2011~2015年度分离PRRSV毒株

3.4 小结

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果

4.3.1 PRRSV Nsp2基因和ORF5基因核苷酸序列相似性分析

4.3.2 遗传进化树分析

4.3.3 GP5蛋白中和抗原表位预测

4.3.4 GP5蛋白抗原位点预测分析

4.4 小结

4.4.1 遗传进化分析

4.4.2 GP5蛋白中和抗原表位分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果

5.3.1 GD-KP株GP5蛋白理化性质分析

5.3.2 GD-KP株GP5蛋白二级结构预测

5.3.3 GD-KP株GP5蛋白三级结构预测

5.3.4 GD-KP株GP5蛋白跨膜区域预测

5.3.5 GD-KP株GP5蛋白亲水性、柔韧性、表面可能性和抗原表位预测分析

5.3.6 GD-KP株GP5蛋白B淋巴细胞抗原表位预测分析

5.3.7 GD-KP株GP5蛋白CpG岛预测

5.3.8 GD-KP株基因信号肽预测

5.4 小结

第6章 PRRSV GD-KP毒株致病性分析

6.1引言

6.2 材料与方法

6.2.2 方法

6.3结果

6.3.1病毒滴度测定结果

6.3.2临床症状和体温变化

6.3.3大体解剖变化

6.3.4组织病理变化

6.4小结

7.1 引言

7.2 材料与方法

7.3 结果

7.3.1 PRRSV免疫PRRS疫苗前后抗体检测

7.3.2 不同疫苗免疫试验猪血清中PRRSV核酸检测

7.3.3生产参数统计分析

7.4 小结

7.4.1 PRRSV抗体变化

7.4.2 仔猪血清中PRRSV核酸检测

7.4.3 生产参数分析

第8章 猪繁殖与呼吸综合征总体防控方案

8.1 引言

8.2 猪群PRRSV的感染状态的评估

8.2.1 临床症状

8.2.2 生产指标

8.2.3 实验室检测

8.2.4 猪群感染状态分类

8.3 制定防控方案并实施

8.3.1 阳性不稳定场（类Ⅰ）的防控方案

8.3.2 阳性稳定场（类Ⅱ）的防控方案

8.3.3 暂时阴性场（类Ⅲ）和阴性场（类Ⅳ）的防控方案

8.3.4 方案实施效果评估

8.4 小结

第9章 全文讨论与结论

9.1 广东省猪繁殖与呼吸综合征流行情况调查

9.2 广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究

9.3 PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白的生物信息学分析

9.4 PRRSV GD-KP毒株致病性分析

9.5 不同疫苗组合对PRRSV类GD-KP毒株免疫效果分析

9.6 猪繁殖与呼吸综合征总体防控方案

致 谢

参考文献

一、主持和参与的科研项目

二、发表的论文

三、授权专利