强力霉素胁迫对大肠杆菌耐药性演化的影响及其机理研究

摘要

养殖业应用兽用抗生素不仅导致环境介质中的兽用抗生素残留，还会对环境微生物形成胁迫，产生更为严重的耐药基因污染。本文以兽用抗生素强力霉素和大肠杆菌K-12为研究对象，通过胁迫驯化试验获得耐药性不同的菌株，从表观结构、生物功能和基因层面探究其耐药性的演化机理。本研究可为微生物对兽用抗生素的耐药性演化预测及耐药基因防控提供理论依据。　　强力霉素胁迫驯化试验设CK、S1、S2、S3和G2组，每组3个重复；前4组每代LB培养基中强力霉素的浓度恒定为0μl/mL、1μl/mL、2μl/mL和3μl/mL，G2组为梯度浓度组，培养基中强力霉素初始浓度为2μl/mL，然后每代强力霉素浓度增加2μl/mL；每代驯化24h 后换代，每次换代以 10%的接种量转移到下一代培养基中，直至G2组达到最大强力霉素耐受浓度时结束试验。从第0代开始，每隔一代采样1次，检测强力霉素对其的最低抑菌浓度（MIC）和半数抑制浓度（IC50）；选择驯化后强力霉素耐药性最高的G2组第0代敏感菌株W、第20代中等耐药菌株M和第38代高耐药菌E，检测并比较分析表观和结构形态、生物功能、基因组及转录组等指标。　　本文所获结果如下：　　（1）强力霉素持续胁迫和梯度胁迫下，大肠杆菌耐药性显著增强（P＜0.05），其中梯度浓度组的耐药性增幅最为显著；S1、S2、S3 和 G2 组强力霉素对大肠杆菌的MIC值分别由4μg/mL分别增加到48、48、48和96μg/mL，IC50值由2.180±0.080μg/mL增加到30.600±0.995、30.227±1.531、32.510±0.590和64.797±0.749μg/mL。　　（2）与敏感菌株W相比，中等耐药菌株M和高耐药菌株E菌落外观未变，均为乳白色、光滑的圆形或椭圆形状，菌体均为短杆状，但菌落大小分别为 0.0244± 0.0120 cm2和0.0252±0.0013 cm2，显著小于敏感菌株的0.1517±0.0063 cm2（P＜0.05），且细胞壁边缘的小突起增多；在强力霉素存在条件下，部分敏感菌株W裂解死亡、胞内物质增多，中等耐药菌株M形态正常但内物质增加，高耐药菌株菌株无变化。　　（3）与敏感菌株W相比，中等耐药菌株M和高耐药菌株E的平稳期生长密度（OD600）分别为0.863±0.022和0.774±0.023，显著低于敏感菌株W的0.923±0.018 （P＜0.05）；生物膜形成量（OD590）分别为0.148±0.004和0.152±0.008，显著高于敏感菌株W的0.119±0.012（P＜0.05）；在1μg/mL降解体系中对强力霉素的降解率分别为 39.83±4.16%和 41.46±3.75%，与敏感菌株 W的39.82±4.85%无显著差异（P＞0.05），但均显著低于不接种培养基的降解率47.17±3.12%（P＜0.05），均抑制了强力霉素的降解；对总碳源的利用强度均显著降低（P＜0.05），但对不同碳源的利用强度无显著差异（P＞0.05）。　　（4）敏感菌株W、中等耐药菌株M和高耐药菌株E中均没检测到四环素耐药基因tetA、tetO、tetM、tetG、tetW和tetX，但均检测到多重耐药基因acrD、acrR、marA和marR；经强力霉素的胁迫驯化，SNP主要分布在中等耐药菌株M和高耐药菌株E的多重耐药基因调控子marA、30S核糖体蛋白S10基因rpsJ和IS5转座酶基因insH1，并且导致细胞代谢、有机氮化合物代谢和肽生物合成等相关代谢途径发生显著下调（P＜0.05）。　　综上所述，强力霉素梯度胁迫更易导致大肠杆菌耐药性的增强，并使耐药菌株的菌落变小、生长性能及碳利用强度降低，其原因与细胞壁结构改变、生物膜形成增加和30s核糖体蛋白S10基因rpsJ的突变增加有关。

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