广东虫草多糖组分分析、免疫与抗氧化活性及Pgm基因初步研究

摘要

广东虫草 (Cordyceps guangdongensis)是我国第二个获批为“新食品原料”的虫草新资源，其子实体具有多种显著的活性功效，如抗氧化、提高免疫力、治疗肾衰竭和延长生物体的生存时间等。已有研究表明多糖是虫草真菌中的重要活性成分，但广东虫草多糖尚未开展系统研究。因此，本论文对广东虫草子实体多糖的制备方法、组成成分、免疫和抗氧化活性进行了较系统的研究，同时对多糖生物合成关键酶基因Pgm也进行了初步探索，为深入研究广东虫草多糖及其合成相关基因功能奠定了基础。　　研究内容及结果如下:　　（1）广东虫草粗多糖提取方法筛选和粗多糖的CPS-1（Crude Polysccharide-1）制备：通过比较四种提取方法，最终确定采用操作简易且成本低的热水浸提法提取广东虫草多糖，并经醇沉、sevage法初级纯化得到CPS，再用透析袋透析，最后冷冻干燥得到粗多糖粉末CPS-1。　　（2）粗多糖分离及特性分析:粗多糖样品CPS经过DEAE-52纤维素凝胶分离获得了两组分PPS-W、PPS-S。经HPLC、GC分析，其单糖组成主要为葡萄糖、甘露糖和半乳糖；傅里叶红外光谱仪分析结果显示其糖苷键的主要类型均为β-型；SEM结果显示表面显微结构均为海绵状。　　（3）抗氧化活性评价:通过分光光度法测定CPS-1、PPS-W和PPS-S对羟基自由基的清除能力、亚铁离子的螯合能力、ABTS的清除能力、DPPH的清除和还原能力，结果显示三个组分的多糖均有显著的抗氧化活性（p＜0.05），其中CPS-1抗氧化活性最佳。　　（4）提高免疫力活性评价:检验CPS-1对正常小鼠的体液免疫功能的影响，结果显示高剂量组的CPS-1可以显著地（p＜0.05）增强小鼠的体液免疫功能。　　（5）多糖合成磷酸葡糖变位酶基因Pgm初步分析:对Pgm基因序列及编码蛋白序列进行了分析，构建了过表达载体，并初步探索了原生质体转化方法。　　通过本论文建立了广东虫草多糖的制备方法，明确了其组成成分及特性，并证实了广东虫草多糖在抗氧化及提高免疫力方面均具有较好的活性功效，并获得了多糖含量的过表达载体，为后期深入研究广东虫草多糖活性功效及开发利用奠定了重要基础。

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1 前言

1.1 虫草多糖的简介

1.1.1 多糖的概念

1.1.2 虫草多糖

1.1.3 虫草多糖的制备、结构及活性研究进展

1.2 α-磷酸葡糖变位酶基因pgm的研究进展

1.2.1 微生物多糖的合成基因研究进展

1.2.2 α-磷酸葡糖变位酶的研究概况

1.3 广东虫草的研究进展

1.3.1 虫草的简介

1.3.2 广东虫草的研究进展

1.4 本研究的目的和意义

1.5 本研究的总技术路线

2 广东虫草多糖的分离纯化与组成成分分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 广东虫草多糖的最佳提取方法筛选

2.2.2 广东虫草多糖AB-8与DEAE两种介质的纯化方式比较

2.2.3 广东虫草多糖PPS-S和PPS-W纯度的鉴定以及组成成分理化性质

2.3 小结与讨论

2.3.1 热水浸提法提取广东虫草多糖可行性高

2.3.2 DEAE纯化法可得到较高纯度的不同多糖组分

2.3.3 分子量相对均一的PPS-S和PPS-W均为β-型吡喃杂多糖

3 广东虫草多糖的生物活性

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果及分析

3.2.1 CPS-1多糖对正常小鼠体液免疫功能的影响

3.2.2 CPS-1、PPS-W和PPS-S的抗氧化活性试验

3.3 小结与讨论

3.3.1 高剂量组的CPS-1显著地增强正常小鼠体液免疫功能

3.3.2 CPS-1、PPS-W和PPS-S均有显著的抗氧化活性

4 多糖生物合成相关酶基因Pgm的同源性分析、结构预测和表达载体构建

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果与分析

4.3.1 目的基因Pgm的DNA、CDS序列的验证

4.3.2 广东虫草Pgm基因序列及蛋白序列的同源性分析和结构预测

4.3.3 OPT-pAN7-1过表达载体的构建

4.3.4 广东虫草GDGM40035菌株原生质体制备

4.4 小结与讨论

4.4.1 广东虫草Pgm的氨基酸序列保守性高

4.4.2 同源重组可构建Pgm表达载体

5.1 结论

5.2 展望

致 谢

参考文献

附 录