重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的纯化及蛋白稳定性研究

摘要

重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)是采用基因融合技术研制而成,临床适应症包括肿瘤、慢性乙型、丙型病毒性肝炎及其它病毒感染性疾病。相对于普通干扰素而言,重组人白蛋白融合干扰素是长效制剂,其临床和社会效益十分显著。
　　本文采用亲和层析方法,对重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)进行纯化研究。比较了3D9单克隆抗体免疫亲和层析和blue sepharose6 fast flow染料亲和层析两种亲和层析体系的纯化效果,并对rHSA-IFNα-2b蛋白的稳定性进行了较全面的研究。
　　利用3D9单克隆抗体亲和层析技术纯化rHSA-IFNα-2b融合蛋白,实验研究发现rHSA-IFNα-2b融合蛋白发酵液上清可直接上样于3D9单抗亲和层析柱,以含有500mmol/L NaCl+0.5％Tween20+50mmol/L Gly的20mmol/L PB洗涤层析柱,洗去非特异性吸附的杂蛋白,随后用20mmol/L PB平衡单抗柱,以500mmol/L NaCl+20mmol/L PB+1.5％HAC+0.5％Tween20+50mmol/L Gly进行洗脱。纯化后的rHSA-IFNα-2b经SDS-PAGE电泳和HPLC分析,纯度达到95％。3D9单抗亲和层析柱对rHSA-IFNα-2b融合蛋白饱和吸附量为8mg/ml。经rHSA-IFNα-2b体外生物学活性检测,蛋白活性为2.45×105IU/ml,折合成单位比活为6.8×105IU/mg,蛋白回收率为81％,活性回收率为35.8％。
　　选用blue sepharose6 fast flow亲和层析柱对rHSA-IFNα-2b进行纯化。本文首先研究了吸附条件,研究发现,rHSA-IFNα-2b融合蛋白发酵液上清不能直接吸附于blue sepharose6 fast flow柱上,直至发酵液上清稀释1倍体积。随后研究了离子浓度对洗脱效果的影响,最终选择在2mol/L NaCl+20mmol/L PB条件下洗脱。纯化后的rHSA-IFNα-2b经SDS-PAGE电泳和HPLC分析,纯度达到84％左右。Blue sepharose6 fast flow亲和层析柱对目的蛋白的饱和吸附量为6.6mg/ml。经rHSA-IFNα-2b融合蛋白体外生物学活性检测,蛋白活性为3.29×105IU/ml,折合成单位比活为7.3×105IU/mg,蛋白回收率为67％,活性回收率为38.4％。
　　将两种亲和层析柱纯化效果进行比较,发现3D9单抗亲和层析柱特异性吸附力强,蛋白回收率高,蛋白纯度好,仅经过一步单克隆抗体亲和层析纯化,目的蛋白的纯度就可达到95％。但是利用单克隆抗体亲和层析凝胶,生产成本较大,而blue sepharose6 fast flow染料亲和层析具有生产成本优势,其配基价格相对低廉,可望降低分离成本。发酵液经blue sepharose6 fast flow亲和层析纯化后,目的蛋白纯度达到84％左右,可再经过疏水层析,离子交换层析等方法达到更高纯度,因此blue sepharose6 fast flow染料亲和层析可以作为生产上替代单克隆抗体亲和层析的一种方法。
　　对rHSA-IFNα-2b融合蛋白稳定性的研究实验结果表明,rHSA-IFNα-2b低温储藏具有良好的稳定性,并对一定范围内的温度、酸碱变化也表现出较强的稳定性。rHSA-IFNα-2b反复冻融后有聚合体产生,冻融次数增加,聚合体含量随之增加,冻融4次后聚合体含量可达17.91％,rHSA-IFNα-2b融合蛋白溶液对冻融很敏感,随着温度的变化会出现聚集现象。所以rHSA-IFNα-2b不宜冻干保存,以液体制剂4℃保存为宜。

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前 言

I.干扰素简介

II. 长效干扰素研究进展

III. 蛋白质层析技术与亲和层析技术的研究进展

IV. 重组蛋白质类药物稳定性研究进展

V.本文的研究内容与意义

第 1 章 重组人白蛋白干扰素?-2b融合蛋白的纯化研究

§1.1 实验材料与仪器

§1.2 实验方法

§1.3 分析与鉴定

§1.4 实验结果

§1.5 讨论

§1.6 结论

第 2 章重组人白蛋白干扰素?-2b融合蛋白的稳定性研究

§2.1 实验材料与仪器

§2.2 实验方法

§2.3 分析与鉴定

§2.4 实验结果

§2.5 讨论

§2.6 结论

研究结论

参考文献

致谢