瓦伦西亚烯细胞工厂的构建及代谢工程改造

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第一章 绪论

1.1 萜类化合物概述

1.2 萜类化合物代谢途径

1.2.1 MVA途径

1.2.2 MEP途径

1.3 酿酒酵母生产萜类化合物

1.3.1 酿酒酵母表达系统

1.3.2 酿酒酵母产萜类化合物研究进展

1.4 基因编辑系统概述

1.4.1 CRISPR/Cas9系统

1.4.2 Cre/loxP系统

1.5 本论文研究背景、意义及内容

1.5.1 研究背景及意义

1.5.2 研究内容

第二章 可回收型质粒的构建及验证

2.1 前言

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 菌株与质粒

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要仪器设备

2.2.4 常用溶液及培养基的配制

2.3 实验方法与步骤

2.3.1 Cre重组酶表达盒的构建

2.3.2 重组质粒P426-Cre的构建

2.3.3 重组质粒P426-CL的构建

2.3.4 重组酵母细胞的构建

2.3.5 重组质粒P426-CL的丢失效率验证

2.4 结果与讨论

2.4.1 Cre重组酶表达盒的构建

2.4.2 重组质粒P426-Cre的构建

2.4.3 重组质粒P426-CL的构建

2.4.4 重组质粒P426-CL的丢失效率

2.5 本章小结

第三章 代谢通路改造提高瓦伦西亚烯产量

3.1 前言

3.2 实验材料与仪器

3.2.1 菌株与质粒

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要仪器设备

3.2.4 常用溶液及培养基的配制

3.3 实验方法与步骤

3.3.1 gRNA靶序列的选择

3.3.2 gRNA表达质粒的构建

3.3.3 同源DNA模板的构建

3.3.4 单基因敲除酵母菌株的构建

3.3.5 多基因敲除酵母菌株的构建

3.3.6 异源表达瓦伦西亚烯酵母菌株的构建

3.3.7 基因敲除酵母菌株发酵

3.4 结果与讨论

3.4.1 gRNA靶序列的确定

3.4.2 gRNA表达质粒的构建

3.4.3 同源DNA模板的构建

3.4.4 基因敲除效果的验证及敲除效率

3.4.5 CnVS表达质粒的构建

3.4.6 基因敲除菌株的双相摇瓶发酵

3.5 本章小结

第四章 FPP 合成途径过表达及CnVS 表达盒筛选

4.1 前言

4.2 实验材料与仪器

4.2.1 菌株与质粒

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要仪器设备

4.2.4 常用溶液及培养基的配制

4.3 实验方法与步骤

4.3.1 双向表达质粒的构建

4.3.2 FPP合成途径过表达的构建

4.3.3 FPP合成途径过表达酵母菌株发酵

4.3.4 CnVS表达盒库的构建

4.3.5 不同CnVS表达盒的酵母菌株发酵

4.3.6 FPP合成途径过表达与最优CnVS表达盒组合的酵母菌株发酵

4.4 结果与讨论

4.4.1 双向表达质粒的构建

4.4.2 双向表达片段敲入的验证

4.4.3 FPP合成途径过表达酵母菌株发酵结果

4.4.4 CnVS表达盒库的构建

4.4.5 含不同CnVS表达盒的酵母菌株发酵结果

4.4.6 FPP合成途径过表达与最优CnVS表达盒组合的酵母菌株发酵结果

4.5 本章小结

第五章 酿酒酵母高密度发酵产瓦伦西亚烯

5.1 前言

5.2 实验材料与仪器

5.2.1 菌株与质粒

5.2.2 主要试剂

5.2.3 主要仪器设备

5.2.4 常用溶液及培养基的配制

5.3 实验方法与步骤

5.3.1 间歇补料发酵

5.3.2 瓦伦西亚烯的检测

5.3.3 发酵液中葡萄糖与乙醇含量的检测

5.4 结果与讨论

5.4.1 葡萄糖及乙醇标准曲线的制作

5.4.2 间歇补料发酵

5.5 本章小结

结论与展望

结论

展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致 谢

答辩决议书