声明
主要符号表
第一章 绪论
1.1 脂肪酶简介
1.1.1 脂肪酶的结构特点
1.1.2脂肪酶的催化机理
1.1.3脂肪酶的来源
1.2 脂肪酶的工业应用
1.2.1 脂肪酶在生物柴油制备工业中的应用
1.2.2 脂肪酶在食品和烘焙工业中的应用
1.2.3 脂肪酶在油脂工业中的应用
1.2.4 脂肪酶在制药、医疗行业中的应用
1.3 单分子层技术与酶的界面吸附特性
1.4 蛋白质晶体学
1.4.1 蛋白质结晶的基础理论
1.4.2 蛋白质晶体衍射及数据处理
1.5 脂肪酶的盖子结构
1.5.1 根据盖子类型的脂肪酶分类法
1.5.2盖子结构对脂肪酶生化特性的影响
1.6 脂肪酶特殊结构的研究进展
1.6.1 脂肪酶的N末端结构
1.6.2 脂肪酶的C末端结构
1.6.3 脂肪酶的帽子亚结构域
1.7.1 研究背景和意义
1.7.2 研究内容
第二章 烟曲霉脂肪酶AFLB克隆表达及其酶学性质表征
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要材料和试剂
2.2.2 主要仪器和设备
2.2.3 培养基以及溶液配制
2.3 实验方法
2.3.1 脂肪酶AFLB的生物信息学分析
2.3.2 烟曲霉GIM3.19菌株培养及其总RNA的提取
2.3.3 反转录PCR克隆脂肪酶AFLB成熟肽的基因序列
2.3.4 脂肪酶AFLB大肠表达载体及其表达工程菌的构建
2.3.5 脂肪酶AFLB的诱导表达
2.3.6 脂肪酶AFLB的纯化
2.3.7 蛋白浓度的测定
2.3.8 脂肪酶AFLB的水解活力测定
2.3.9 脂肪酶AFLB最适反应温度和温度耐受性的测定
2.3.10 脂肪酶AFLB最适反应pH的测定
2.3.11 氯化钠对脂肪酶AFLB的活力与稳定性影响
2.3.12 金属离子、表面活性剂和有机溶剂对脂肪酶AFLB酶活力的影响
2.3.13 脂肪酶AFLB的底物选择性测定
2.3.14 脂肪酶AFLB对甘油三酯的位置选择性测定
2.4 结果与讨论
2.4.1 脂肪酶AFLB氨基酸序列的生物信息学分析结果
2.4.2 脂肪酶基因aflb的克隆结果
2.4.3脂肪酶AFLB的表达与纯化结果
2.4.4 脂肪酶AFLB的最适反应温度和温度耐受性
2.4.5 脂肪酶AFLB的最适反应pH
2.4.6 二价金属阳离子和不同浓度氯化钠对脂肪酶AFLB酶活力的影响
2.4.7 有机溶剂和表面活性剂对脂肪酶AFLB酶活力的影响
2.4.8 脂肪酶AFLB的脂肪酸链长选择性和位置选择性
2.5 本章小结
第三章 脂肪酶AFLB 晶体制备及结构解析
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要材料与试剂
3.2.2 主要实验仪器
3.2.3 溶液配制
3.3.1 脂肪酶AFLB凝胶过滤层析纯化
3.3.2 脂肪酶AFLB结晶浓度的筛选
3.3.3 脂肪酶AFLB结晶条件的筛选和优化
3.3.4 脂肪酶AFLB晶体的观察
3.3.5 脂肪酶AFLB晶体防冻剂的配制
3.3.6 脂肪酶AFLB晶体的捞取及保存
3.3.7 X射线衍射晶体
3.3.8 晶体X射线衍射数据分析
3.4 结果与讨论
3.4.1 脂肪酶AFLB凝胶过滤层析纯化结果
3.4.2 脂肪酶AFLB结晶条件的筛选和优化
3.4.3 脂肪酶AFLB晶体衍射数据处理
3.4.4 脂肪酶AFLB的晶体结构
3.4.5 脂肪酶AFLB与脂肪酶CALB序列和晶体结构比对
3.4.6 脂肪酶AFLB与已知的带有“帽子”结构的脂肪酶/酯酶的结构对比
3.5 本章小结
第四章 脂肪酶AFLB 的盖子结构与N 端亚结构域对活力的调控机制研究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 主要材料与试剂
4.2.2 主要仪器和设备
4.2.3 培养基以及溶液配制
4.3.1 脂肪酶AFLB突变体表达载体构建及其蛋白表达纯化
4.3.2 脂肪酶 AFLB 突变体水解活力、最适反应温度和 pH、热稳定性的测定
4.3.3 脂肪酶AFLB野生型与盖子突变体的反应动力学常数测定
4.3.4 脂肪酶AFLB野生型与盖子突变体蛋白的熔解温度测定
4.3.5 脂肪酶AFLB野生型与N端突变体的界面吸附参数测定
4.3.6 分子动力学模拟
4.4 结果与讨论
4.4.1 脂肪酶AFLB的盖子突变体和N末端截短突变体的制备
4.4.2 脂肪酶AFLB盖子结构对酶活力的调控
4.4.3 脂肪酶AFLB的N末端亚结构域对酶活力的调控
4.5 本章小结
结论与展望
1. 主要结论
2. 论文创新
3. 后期工作展望
参考文献
附 录
1. 基因序列信息
2. 蛋白序列信息
攻读博士期间取得的研究成果
致 谢
答辩决议书
华南理工大学;
