解脂耶氏酵母脂肪酶YLLip2结构与功能关系研究

摘要

解脂耶氏酵母脂肪酶YLLip2是一种常见脂肪酶，在众多领域有着广泛应用。它具有真脂肪酶的独特性质—界面激活效应。YLLip2闭合构象时的结构已被解析，但其开放构象时的状态才是其发挥催化功能时的状态。目前关于YLLip2开放构象时的结构信息报道较少，其结构和功能的关系研究也不够充分，尤其是对其界面激活机制的研究。本论文在构建和分析YLLip2开放构象时结构模型的基础上，构建了一系列YLLip2突变体，研究了点突变对其酶学性质和界面激活特性的影响，以期进一步阐明其结构与功能关系，为更好的利用和改造YLLip2提供理论支撑。主要研究工作和结果摘要如下：
　　1.改造了一个解脂耶氏酵母表达载体。将原有载体中油酸诱导的启动子（pPOX2）替换成了高效的类组成型启动子（hp4d）并引入了信号肽（signal peptides）。利用此载体表达并纯化了YLLip2，研究了其酶学性质和界面激活特性。结果表明YLLip2最适底物为p-NPC12，对中长链的对硝基苯酚酯表现出偏好性，最适反应温度为40oC，40oC处理4h后残余酶活仅为17.3％，最适pH为8.0，YLLip2具有典型的界面激活效应，这都印证了YLLip2的真脂肪酶特性。
　　2.采用同源建模的方法构建了YLLip2开放构象（YLLip2-oc）时的结构模型，分析表明，YLLip2-oc的结构与AnFaeA的结构有较高的相似性，二者较大的区别在于前者的底物结合区域比后者的底物结合区域含有更多的疏水性氨基酸残基。此外，YLLip2-oc的盖子结构（lid subdomain）与AnFaeA的帽子结构（cap region）重合性较好，但盖子结构中疏水残基较的帽子结构多，推测底物结合区域和盖子结构疏水性残基对脂肪酶的功能具有较大影响。
　　3.构建了YLLip2底物结合区域的突变体I100Y，F129Y和I100YF129Y，研究了它们的酶学性质与界面激活特性。三者的最适底物分别为p-NPC10，p-NPC4和p-NPC4；最适温度分别为40oC，45oC和45oC，三者的热稳定性较YLLip2均有所提升；最适pH分别为7.5，7.0和6.0；三者的界面激活特性较YLLip2均有所减弱。结合已有的信息，我们推测I100和F129参与了YLLip2底物的识别和界面激活。从进化的角度分析，YLLip2与AnFaeA来源于同一祖先蛋白，这两个氨基酸可能是二者在趋异进化中的分界点。
　　4.构建了YLLip2盖子区域的单点突变体L91D，I95Q，I98T，研究了它们的酶学性质与界面激活特性。三者的最适底物分别为p-NPC12，p-NPC12和p-NPC10，最适温度均为40oC，三者的热稳定性较YLLip2均有所增强，最适pH分别为7.5、7.5和8.0；三者的界面激活特性较YLLip2均有所减弱，推测YLLip2盖子区域的疏水性影响着其活性和界面激活特性。
　　5.构建了底物结合区域芳香族氨基酸引入的突变体V94W，I100F和V94WI100F，研究了它们的酶学性质与界面激活特性。三者的最适底物分别为p-NPC12、p-NPC10和p-NPC10，三者的最适温度均为35oC，三者的热稳定性具有所提升；三者的最适pH分别为7.5、8.0和6.0。三者的界面激活特性均有所增强。这表明引入的芳香族氨基酸残基影响了其活性和界面激活特性。

目录

声明

1 绪论

1.1 脂肪酶概述

1.2 脂肪酶的分类

1.3 脂肪酶的结构

1.4 脂肪酶的催化机制

1.5 脂肪酶的界面激活

1.6 基于结构信息的脂肪酶改造研究进展

1.7 解脂耶氏酵母脂肪酶YLLip2的研究进展

1.8 本研究的目的及意义

2 解脂耶氏酵母表达系统的改进与YLLip2的同源表达

2.1 材料与方法

2.2 实验步骤

2.3 实验结果

2.4 讨论与小结

3 YLLip2开放构象时结构模型的建立与分析

3.1 材料与方法

3.2 实验步骤

3.3 实验结果

3.4 讨论与小结

4 YLLip2底物结合区域的突变对结构和功能的影响

4.1 材料与方法

4.2 实验步骤

4.3 实验结果

4.4 讨论与小结

5 YLLip2盖子区域突变对脂肪酶结构和功能的影响

5.1 材料与方法

5.2 实验步骤

5.3 实验结果

5.4 讨论与小结

6 结构一致性指导的YLLip2突变体的构建

6.1 材料与方法

6.2 实验步骤

6.3 实验结果

6.4 讨论与小结

7 全文总结与展望

7.1 全文总结

7.2 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的学术论文目录

附录2 主要仪器设备

附录3 主要缩写词

附录4 YLLip2基因与蛋白序列