兔尿源性干细胞复合小肠粘膜下层脱细胞基质构建组织工程尿道的研究

摘要

尿道损伤的病因包括创伤、先天性畸形、感染等，临床上主要表现为尿道狭窄、闭锁或缺失，导致排尿功能障碍，甚至可使膀胱、肾脏功能受损，严重影响患者生活质量。尿道狭窄的治疗措施包括包括尿道扩张、尿道内放置支架、尿道内切开、尿道端-端吻合和尿道成形术等。其中，尿道端-端吻合术能解决长度小于2cm的狭窄。但当尿道狭窄长度大于2cm时，直接采用狭窄段切除、端-端吻合的常规手术方法，会导致阴茎弯曲、勃起疼痛。因此，对于长度大于2cm的尿道狭窄须采用新的尿道替代材料进行尿道的修复与重建。　　目的:　　长段尿道的狭窄或缺失是临床上泌尿外科医生面临的一个比较棘手的难题，组织工程技术是解决这一难题的途径之一。本研究拟以诱导分化后的尿源性干细胞(USCs)为种子细胞，经5％过氧乙酸(PAA)氧化脱细胞处理的小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS)为支架，于体外构建成组织工程尿道，为后续长段尿道损伤的动物实验研究提供尿道修复材料。　　方法:　　通过无菌导尿术收集6只健康成年雄性新西兰大白兔（体重2.0～2.5kg之间）尿液。采用离心分离法分离尿源性干细胞，于体外诱导其向尿路上皮细胞和平滑肌细胞方向分化;取健康猪小肠，物理方法获取小肠粘膜下层，系统比较经不同浓度过氧乙酸(PAA)氧化脱细胞处理的SIS的体外机械性能、残余DNA量、残余生长因子含量、电镜检测、切片染色及细胞粘附性等结果，确定SIS的最佳制备方法;于体外将诱导分化的上皮细胞和平滑肌细胞作为种子细胞种以“分层共培养”的方式在动态的环境下种植于SIS上，通过组织切片染色等相关组织学检查检测细胞于SIS上的复合效果。　　结果:　　经5％PAA氧化脱细胞处理的SIS脱细胞彻底，组织间孔隙多，内部疏松，更有利于种子细胞粘附、渗透、增殖和分化，可作为组织工程尿道的支架材料;与静态培养环境相比，动态培养环境加强了细胞在SIS的渗透作用，“分层共培养”使细胞能够形成多层的生长状态，以此方式构建的组织工程尿道，使尿源性干细胞诱导分化的尿路上皮细胞、平滑肌细胞能以类似尿道组织细胞分布层次的形式种植进SIS内，所构建的组织工程尿道与真实尿道结构更加相似。　　结论:　　采用经5％PAA氧化脱细胞处理的SIS作为支架材料，USCs为种子细胞，以“分层共培养”+动态培养的方式所构建的组织工程尿道，可作为尿道修复或重建的一种新型尿道替代材料。

目录

声明

摘要

引言

第一章 兔USCs原代培养与诱导分化

1．1 兔尿液的收集及USCs的分离培养

1．1．1 材料

1．1．2 实验方法

1．2 兔USCs生长曲线的测定

1．2．1 材料

1．2．2 实验方法

1．3 兔USCs体外向上皮细胞(UCs)和平滑肌细胞(SMCs)方向诱导

1．3．1 材料

1．3．2 实验方法

1．4 USCs诱导分化细胞的鉴定

1．4．1 材料

1．4．2 实验方法

1．5 实验结果

1．5．1 兔尿液的收集及USCs的分离培养

1．5．2 兔尿源性干细胞生长曲线

1．5．3 兔尿源性干细胞多潜能分化(上皮分化和平滑肌分化)

1．5．4 兔USCs诱导分化的细胞鉴定

1．6 讨论

1．6．1 兔尿源形干细胞(USCs)

1．6．2 尿源性干细胞诱导分化为上皮细胞和平滑肌细胞

第二章 小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS)的制备与检测

2．1 小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS)的制备

2．1．1 材料

2．1．2 实验方法

2．2 SIS电镜扫描观察

2．3 SIS的HE检测

2．3．1 材料

2．3．2 实验方法

2．4 SIS的Hoechst染色

2．4．1 材料

2．4．2 实验方法

2．5 经不同浓度PAA氧化脱细胞处理的SIS单轴力学拉伸实验测定

2．5．1 材料

2．5．2 实验方法

2．6 经不同浓度PAA处理的SIS的残余DNA量测定

2．6．1 材料

2．6．2 实验方法

2．7 经不同浓度PAA处理的SIS的生长因子TGF-β、VEGF的残余量测定

2．7．1 材料

2．7．2 实验方法

2．8 SIS的细胞毒性研究

2．8．1 材料

2．8．2 实验方法

2．9 统计学方法

2．10 实验结果

2．10．1 SIS的大体标本观察

2．10．2 SIS电镜扫描观察

2．10．3 SIS的组织学检查(HE染色和Hoechst染色)

2．10．4 经不同浓度PAA氧化脱细胞处理的SIS单轴力学拉伸测定结果

2．10．5 经不同浓度PAA处理的SIS的残余DNA量测定结果

2．10．6 经不同PAA浓度处理的SIS中的生长因子TGF-β、VEGF的残余量测定结果

2．10．7 USCs在SIS上的黏附实验研究

2．11 讨论

第三章 初级组织工程尿道的体外构建

3．1 初级组织工程尿道的体外构建

3．1．1 材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 复合支架的HE检测和Hoeehst染色

3．2．2 初级组织工程尿道的Masson三色染色和Hoechst染色

3．3 讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢