基于噻唑橙的核酸荧光探针的设计与应用

摘要

核酸作为生命的遗传物质，其结构的完整性决定了细胞是否能够维持正常的生理功能以及细胞的分裂增殖、分化。核酸结构的完整性也同时决定了生命体能否正常地生长发育，生命体繁殖过程中的遗传与变异。DNA分子结构的多样性对其性质以及功能影响甚大。在临床上的化学抗癌疗法便是以DNA为化学药物作用靶标，这是癌症治疗的一种有效手段，脱氧核糖核酸（DNA）也被广泛地用于疾病的诊断、药物的设计。因此简便，高灵敏度，选择性地识别各种结构的核酸向来是科学家们所关注的热点。荧光探针由于其灵敏度高、响应快、成本低，近年来得到了广泛的研究。据此，本人在前人的工作基础上做了以下这些工作。　　1.合成了一种新型基于碳量子点（CDs）的纳米荧光探针（CDs-TO），可用于检测双链DNA以及平行G-四链体DNA。噻唑橙（TO）是一种DNA有机小分子荧光探针，将其作为识别和荧光响应单元，经过酰胺化反应共价结合在碳量子点表面。在没有DNA的条件下，这个纳米探针仅仅发射CDs部分的蓝色荧光，而TO几乎没有荧光。当加入DNA后，在530 nm出现了TO部分的荧光发射，并随着DNA浓度的增加而荧光逐渐增强，在此同时CDs的荧光强度保持不变，从而实现靶标DNA的比例荧光检测。CDs-TO纳米探针对双链DNA（ds）和平行G-四链体（G4）有很好的选择性。此外CDs-TO展现了很高的灵敏度，ssab （dsDNA）和c-myc（平行G4）的检测限分别为0.9和3.31 nmol。另外，通过G4/hemin 过氧化酶实验验证了CDs-TO与G4是通过末端堆积模式结合的。　　2.合成了TO的衍生物TO-NH2，TO-COOH，通过共聚焦和流式细胞实验比较了TO、TO-NH2、TO-COOH在细胞内的定位以及进细胞的能力。　　3.设计合成了邻菲罗啉和噻唑橙组成的新型荧光探针。并用荧光光谱研究了其与不同结构DNA结合后的荧光响应。

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Design and Application of Nucleic Acid Fluorescenc

Abstract

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第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 DNA的二级结构

1.2.1 DNA的双螺旋结构

1.2.2 DNA G-quadruplex的结构

1.2.3 DNA G-quadruplex的生理功能

1.3.1 吖啶、菲啶类

1.3.2 菁类

1.3.3 罗丹明和荧光素类

1.3.4 噻嗪和噁嗪类染料

1.3.5 BODIPY(Boron dipyrromethene difluoride)类染料

1.3.6 苯并咪唑类染料

1.3.6 咔唑类染料

1.4 小分子探针与DNA相互作用方式

1.4.1 非共价键结合

1.4.2 共价结合

1.4.3 剪切作用

1.4.4 长距组装

1.5 DNA与小分子结合的研究方法

1.5.1 光谱法

1.5.2 其他方法

1.6 纳米碳点概述

1.7 纳米碳点的合成方法

1.7.1 自上而下法

1.7.2 自下而上法

1.8 碳量子点的化学修饰

1.8.1 化学修饰碳点实现表面钝化

1.8.2 化学修饰碳量子点实现发光调控

1.8.3 化学修饰碳点实现功能化

1.9 本论文设计思路与研究内容

第二章 CDs-TO的合成、表征以及与不同结构DNA相互作用的研究与应用

2.1 实验部分

2.1.1 核酸

2.1.2 试剂与材料

2.1.3 仪器与设备

2.1.4 CDs-TO的合成

2.1.5 紫外可见吸收光谱的测定

2.1.6 荧光光谱测定

2.1.7 选择性和抗干扰实验

2.1.8 结合模式研究

2.1.9 人血清样品分析

2.2 实验结果与讨论

2.2.1 制备和表征CDs和CDs-TO纳米探针

2.2.3 干扰实验

2.2.4 与G4s的结合模式研究

2.2.5 对ssab和c-myc的灵敏度测定

2.2.6 血清样品实验

2.3 本章小结

参考文献

第三章 TO、TO-COOH、TO-NH2的细胞实验

3.1 实验部分

3.1.1 试剂与材料

3.1.2 仪器与设备

3.1.3 TO-NH2的合成

3.1.4 流式细胞分析

3.1.5 激光共聚焦成像

3.1.6 细胞毒性实验

3.2 结果与讨论

3.2.1 流式细胞实验结果

3.2.2 共聚焦成像实验结果

3.2.3 细胞毒性实验结果

3.3 本章小结

第四章 TO-PDA的合成及光谱表征

4.1 实验部分

4.1.1 试剂与材料

4.1.2 核酸

4.1.3 仪器与设备

4.1.4 TO-PDA的合成

4.1.5 紫外可见光谱测定

4.1.6 荧光光谱测定

4.2 实验结果与讨论

4.2.1 TO-PDA的紫外可见吸收光谱

4.2.2 TO-PDA的荧光光谱

参考文献

全文结论

硕士期间的研究成果

致 谢