Bt肠毒素基因的序列分析及安全性研究

摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），从1956年开始商业化生产至今，已广泛应用于防治农林病虫害，是一种应用成功的微生物杀虫剂，它的安全性关系到全人类的健康。而与它亲缘性很近的蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus，简称Bc）是众人周知的条件致病菌，它所产生的肠毒素是引起腹泻的重要因素之一，研究表明，Bt中也广泛存在肠毒素基因。所以本课题以Bt肠毒素的安全性为出发点进行一系列研究，为Bt的安全应用提供一定的理论基础。　　采用6对引物对本室保存的40株不同来源的Bt菌株肠毒素基因（ent、hblA、bceT、nheA、nheB、nheC）进行PCR检测。结果表明，其中30株Bt全部含有这6个基因。而在这6个被检肠毒素基因中，nheC基因的检出率达到100％，nheA、nheB基因的检出率仅低于nheC基因，达到95%，检出率最低的是bceT基因，也达到了82.5%，此外，hblA基因及ent基因的检出率分别为87.5%、90%，这说明肠毒素基因确实广泛存在于Bt中。　　以BRC-LLP29及BRC-XQ9为模板，克隆肠毒素基因ent、hblA、hblB、hblD、nheA的ORF。用NCBI BLAST软件对Bt与Bc肠毒素的氨基酸序列进行比对，发现它们之间的相似度非常高，其中，二者的ent基因氨基酸序列同源性达到98%，而hblA、hblB、hblD、nheA基因的氨基酸序列与Bc同源性均达到了99%。　　用BRC-LLP29及BRC-XQ9的nheA基因体外诱导表达NheA-pET32a融合蛋白，并对其和出发菌株的发酵液进行Tecra BDE VIA试剂盒检测及小鼠急性口服试验，探究其表达活性和生物毒性。结果表明，含有NheA-pET32a融合蛋白的发酵液表达活性非常高，出发菌株的发酵液也被检测到肠毒素表达活性，但是在小鼠口服试验中却没有表现相应的生物毒性。随后对小鼠进行解剖，发现小鼠的胃肠粘膜光滑，没有充血、胀气现象，各脏器外形、大小比例及色泽均无异常。整个实验过程中没有出现小鼠死亡情况。　　将毒素调控因子plcr基因的上游片段、下游片段以及pMAD质粒进行连接，构建plcr基因敲除载体，为探究肠毒素表达调控机制奠定基础。

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第一章 绪论

1 苏云金芽胞杆菌

2 苏云金芽胞杆菌肠毒素研究现状

3 苏云金芽胞杆菌与蜡质芽胞杆菌

4 毒素调控因子PlcR

5 本课题的研究目的及意义

第二章 Bt肠毒素基因检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第三章 Bt肠毒素基因克隆与序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第四章 B t Nhe A蛋白表达及活性测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第五章 Bt plcr基因敲除

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第六章 讨论与总结

参考文献

附录

致谢