一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用

摘要

本发明公开了一种优化的产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用，属于生物技术领域。本发明根据乳酸乳球菌密码子使用偏好，大片段合成了包含引起断奶仔猪腹泻的常见ETEC优势血清型的F4+的主要结构蛋白FaeG、F18+的受体结合域RBD和毒素Stx2e、STa突变体、LT B亚单位、STb 6种抗原基因以及分别靶向M细胞、肠道细胞的分子肽CO1、YadA31基因的多价抗原基因序列，各基因间由GGGGS连接而成。该基因不但可以用于构建乳酸菌活载体疫苗，显著提高目的蛋白的分泌表达量，具有良好的免疫原性和保护效应，而且也适用于在大肠杆菌中高效表达，实验证明，其包涵体具有良好免疫活性，可作为预防断奶仔猪F4+、F18+ETEC感染的疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种合成的密码子优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列 及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

断奶仔猪腹泻是长期困扰猪场和养殖户的一个难题，不仅带来直接的死亡损失 和巨额的药费开支，还间接影响到康复猪下一阶段的生长速度、育成率，危害相当 严重，成为全球范围内影响提高养猪业经济效益的重要制约因素。肠产毒性大肠杆 菌(enterotoxigenic Esckrichia coli，ETEC)是断奶仔猪腹泻的主要病原体，也是断奶 仔猪腹泻的重要诱因；其中以F4⁺、F18⁺ETEC占据明显优势地位，因此控制F4⁺、 F18⁺ETEC感染成为防治断奶仔猪腹泻的关键环节。据报道，从断奶仔猪腹泻样品 中分离的ETEC多数表达Stx2e毒素、STa毒素突变体、LT毒素、STb毒素等。新 生仔猪从母体获得的免疫力在断奶之后就不能有效抵抗病原微生物的感染，疫苗接 种将成为是特异性预防ETEC的有效手段，而安全有效的疫苗是成功地预防、控制 ETEC引起的断奶仔猪腹泻的先决条件，然而目前还没有商品化的疫苗取得成功。

国内外的科研人员一直都在探索预防断奶仔猪腹泻主动免疫的策略和方法，在 基于F4⁺ETEC黏附素F4或者其主要成分的FaeG蛋白的亚单位疫苗或基因工程疫 苗、核酸疫苗研究以及携带黏附素的无毒大肠杆菌口服活疫苗研究等领域均取得积 极进展。这些疫苗免疫哺乳仔猪虽可以诱导一定程度的免疫应答，但是还不足以保 护仔猪免受感染。分析其原因，除了断奶前后仔猪免疫系统发育尚不完善之外，至 少包含以下几点：①研究使用的蛋白类抗原口服后，在穿过胃肠屏障时损失较大， 所剩免疫原无法有效被仔猪的免疫系统所识别；②不能在感染发生的部位诱导产生 足够多的sIgA，而在黏膜免疫应答中sIgA才是抵抗感染的主力军；③母源抗体干 扰：针对菌毛粘附素的母源抗体，可能会使疫苗菌株在肠内无法定居，达不到激活 免疫应答的有效细菌数量。④目前的研究大都是基于F4、F4菌毛或者其主要亚单 位FaeG、FedF的，免疫原组成单一。事实上，抗毒素抗体在抵抗ETEC感染过程 中同样起到重要作用。⑤没有把免疫原有效地传递给APC，也没有充分利用肠道的 非特异性免疫，无法激活更多的初始T细胞参与。基于上述原因，目前国内外研究 者都在寻求一种更加安全和有效的可用于预防断奶仔猪腹泻的疫苗，以克服现有疫 苗研究中存在的缺点和不足，其中，利用乳酸菌活载体构建的基因工程活载体疫苗 被认为是一种前景的研究方向。

乳酸菌作为人和动物肠道主要的益生菌群之一，具有多种健康功效，诸如乳酸 菌能非特异性提高人和动物的胃肠道粘膜免疫功能，乳酸菌产生的乳酸菌素、细菌 素、乳酸和其它多种有机酸类具有抑菌、抗腹泻作用，在调节肠道菌群失调，增强 肠道粘膜免疫功能，预防肠道传染性疾病发挥重要作用；乳酸菌本身对黏膜有良好 的黏附和肠道定植功能，并且乳酸菌细胞壁的胞壁酰二肽亦具有免疫佐剂作用等。 因此，乳酸菌可以作为表达外源抗原的活载体，携带外源抗原基因的乳酸菌质粒可 表达相应外源蛋白并能诱导特异性的局部黏膜和系统免疫应答，这为利用乳酸菌进 行异性的疾病预防奠定了重要的理论和实践基础。但是，目前乳酸菌活载体疫苗研 究的一个局限就是对其遗传背景研究减少，异源基因表达量普遍较低，免疫原性较 弱，免疫效果还比较差。如何提高异源基因表达量，尤其是抗原的分泌表达量，提 高免疫原性成为构建和设计乳酸菌活载体疫苗研究的关键所在。

迄今为止，还没有包含有引起断奶仔猪腹泻的ETEC F4⁺的主要结构蛋白FaeG、 F18⁺受体结合域RBD、Stx2e毒素、STa毒素突变体、LT毒素B亚单位、STb毒素 6种抗原的融合基因的报道，也未见到同时使用靶向M细胞的分子肽CO1、靶向肠 道细胞的分子肽YadA31两种靶向肽增强免疫应答的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列， 该基因含有编码猪产肠毒素性大肠杆菌抗原F4⁺FaeG(V94E)、F18受体结合域 RBD、Stx2e毒素、STa毒素突变体、LT毒素B亚单位、STb毒素共计6种抗原以 及靶向M细胞的分子肽CO1、靶向肠道细胞的分子肽YadA31的基因，各基因间由 柔性肽GGGGS linker连接而成。

本发明的目的之二是提供一种含有并且能够高效表达上述基因的重组乳酸乳 球菌和重组大肠杆菌。

本发明目的之三是将上述重组乳酸乳球菌和重组大肠杆菌应用于预防或治疗 ETEC引起的断奶仔猪腹泻。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列，含有编码猪产肠 毒素性大肠杆菌抗原FaeG、F18受体结合域RBD、Stx2e毒素、STa毒素突变体、 LT毒素B亚单位、STb毒素共计6种抗原以及靶向M细胞的分子肽CO1、靶向肠 道细胞的分子肽YadA31的基因，各基因间由柔性肽GGGGS连接而成，所述多价 抗原基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

进一步的，本发明还提出了一种产肠毒素性大肠杆菌多价抗原，其由SEQ ID  NO:1所示的核苷酸序列编码。

含有本发明所述的优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列的宿主细胞 也在本发明的保护范围之内。

其中，优选的，所述的宿主细胞为重组乳酸乳球菌或重组大肠杆菌。

将SEQ ID NO：l所示的碱基序列与乳酸乳球菌表达载体相连接，得到重组乳 酸乳球菌表达载体；将重组乳酸菌载体电转化导入宿主菌中即可筛选到得到一种重 组乳酸乳球菌，该重组乳酸菌可以分泌的形式表达上述基因所编码的抗原蛋白。该 重组菌即可作为有效活性成分制备基因工程活载体疫苗免疫仔猪。

将SEQ ID NO：l所示的碱基序列与大肠杆菌表达载体相连接，得到重组大肠 杆菌表达载体；将重组大肠杆菌表达载体转化到宿主菌BL21中，筛选，鉴定，即 可得到能够高效表达带有靶向分子的ETEC多价抗原的一种重组大肠杆菌。大量培 养后，诱导表达，经纯化即可获得表达上述基因所编码的抗原蛋白的包涵体蛋白。 后者即可作为有效活性成分制备基因工程亚单位疫苗免疫仔猪。

再进一步的，本发明还提出了所述的优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因 序列在制备猪产肠毒素性大肠杆菌多价抗原或基因工程活载体疫苗中的应用。及

所述的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原在制备预防或治疗肠产毒性大肠杆菌引 起的断奶仔猪腹泻的药物中的用途。以及

所述的宿主细胞在制备预防或治疗肠产毒性大肠杆菌引起的断奶仔猪腹泻的 药物中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、该基因涵盖了引起断奶仔猪腹泻ETEC中的以占据明显优势地位F4⁺、F18⁺ETEC负责黏附的菌毛关键部位和四种最为常见的毒素基因，其表达产物诱导产生 的抗体不但可以抵抗F4⁺、F18⁺ETEC黏附，中和其产生的毒素，还可以中和其他 非F4⁺、F18⁺ETEC产生的Stx2e毒素、STa毒素、LT毒素、STb毒素，将会诱导 产生更加广泛的、更加全面的保护性应答反应。

2、优化的双靶向型ETEC多价抗原编码基因在重组乳酸乳球菌中的表达量提 高，并且以分泌形式表达目的蛋白量得到明显提高。表达的蛋白也具有良好的抗原 性。

3、用本发明制备的重组乳酸菌免疫动物，具有良好的免疫原性，口服动物可 以诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，也可产生局部黏膜免疫应答。靶向分 子具有提高免疫效果的作用，并且这两个靶向分子具有协同增强免疫应答的能力。 本发明制备的重组乳酸菌可以作为基因工程活载体疫苗使用。

4、优化的双靶向型ETEC多价抗原编码基因插入大肠杆菌表达载体，导入宿 主菌后，依然能够实现重组融合蛋白的大量表达，表达的蛋白具有抗原性；用本发 明所制备的重组大肠杆菌表达所得的包涵体直接作为活性成分免疫动物，就可以诱 导动物产生免疫应答，同样具有良好的免疫原性，同时靶向分子具有提高免疫效果 的作用。该包涵体可以作为基因工程亚单位疫苗使用。

5、采用本发明重组蛋白以包涵体形式用作基因工程亚单位疫苗经口服、滴鼻、 肌肉注射等途径，或者以重组乳酸乳球菌用作基因工程活载体疫苗经口服、滴鼻等 途径，用于预防断奶仔猪F4⁺、F18⁺ETEC感染，能够有效的保护仔猪抵抗至少2 ×10¹⁰CFU ETEC攻击，疫苗免疫后产生的免疫应答可以缩短感染猪的排毒时间， 对减少猪场内感染机会，猪群快速恢复健康状态具有重要意义。此外，口服免疫乳 酸菌活载体疫苗还可以提高和改善试验猪攻毒后的平均日增重。

6、本发明的制备方法简单，生产成本低廉。

附图说明

图1为基因组织结构示意图；

图2为基因点突变引起的亲水性变化分析；

图3为pNZ8112载体图谱；

图4为重组乳酸乳球菌培养上清(a)与菌体(b)中表达目的蛋白的western Blot 鉴定图；

其中泳道1蛋白分子量标准；2含pNZ8112载体的重组乳酸乳球菌诱导后培 养上清(a)与菌体(b)；3pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/NZ9000 诱导后培养上清(a)与菌体(b)；4pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1 /NZ9000诱导后培养上清(a)与菌体(b)；5pNZ8112-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/NZ9000诱导后培养上清(a)与菌体(b)；6 pNZ8112-FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/NZ9000诱导后培养上清 (a)与菌体(b)

图5是优化的基因在重组大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图；

其中泳道1蛋白分子量标准；2pET28a/BL21诱导后菌体；3pET28a/BL21诱 导前菌体；4pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/BL21诱导后菌体；5 pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1/BL21诱导后菌体；6 pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/BL21诱导后菌体；

图6是从包涵体中提取纯化的重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；

其中泳道1蛋白分子量标准；2pET28a/BL21诱导后菌体超声上清；3 pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/BL21诱导后菌体超声沉淀；4纯化后 的重组mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb包涵体；5pET28a-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1/BL21诱导后菌体超声上清；6pET28a-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1/BL21诱导后菌体超声沉淀；7纯化后的重组 mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1包涵体；8pET28a-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/BL21诱导后菌体超声上清；9pET28a- mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/BL21诱导后菌体超声沉淀；10 纯化后的重组mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31包涵体；

图7是优化的基因在重组大肠杆菌中表达的western Blot鉴定图；

其中泳道1pET28a/BL21诱导后菌体；2pET28a/BL21诱导前菌体；3 pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/BL21诱导后菌体；4 pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1/BL21诱导后菌体；5 pET28am-FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/BL21诱导后菌体；6蛋白 分子量标准；

图8为重组乳酸菌免疫后血清特异性IgG检测结果；

图9为重组乳酸菌免疫后粪便中抗F4sIgA检测结果；

图10为重组乳酸菌免疫后粪便中抗LTB sIgA检测结果；

图11为重组乳酸菌免疫后粪便中抗FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋 白sIgA检测结果；

图12为包涵体免疫后血清特异性IgG检测结果；

图13为包涵体免疫后粪便中抗F4sIgA检测结果；

图14为包涵体免疫后粪便中抗LTB sIgA检测结果；

图15为包涵体免疫后粪便中抗FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋白 sIgA检测结果；

图16为包涵体免疫小鼠后用ETEC攻毒后粪便中排除细菌情况检测结果；

图17为免疫后猪血清特异性IgG检测结果；

图18为免疫后猪血清特异性sIgA检测结果；

图19为攻毒后各组试验猪平均日增重情况检测结果；

图20为攻毒后各组试验猪粪便中排菌情况检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术 方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围 内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中 所使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。

实施例1优化后的ETEC FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31融合 基因片段的获得

优化前基因的获得：在本发明人前期研究获得的FaeG(成熟肽)、STa-LTB-STb 融合基因(见本发明人之一高菲硕士学位论文.表达F4+ETEC的靶向性乳酸杆菌活 菌载体的构建及其免疫原性分析.东北农业大学.2013)、Stx2e(见本发明人之一师东 方发表的文章Yufei Feng,Wenxin Liu,Dongfang Shi.Effectiveness of egg folk  antibody against Shiga toxin II variant toxicity in vitro and in vivo.Curr MICROBIOL, 2013,67:448-453.)的基础上，设计引物扩增F18RBD：上游引物P1： 5’-ggaactttgacatgccaggctggaactattttggtatggaaaaatgggcgcgaaacccaatatgcgctcgagtgtcgtgtGa gcattcaccatag-3’，下游引物P2： 5’-tttatttccacatgctgtaccgaatcctacttgtgactgttgcccccactgagattcattaatggagccagaactatggtgaatgc tcacac-3’，两条引物末端互补，退火后则互为模板PCR扩增即可得到目的基因F18 RBD)，然后合成引物(见下表)使用SOE-PCR技术(见文献Nikolai AS,Anton VB, Yevgeniya AN,et al.Construction of long DNA molecules using long PCR based fusion  of several fragments simultaneously.Nucleic Acids Research,2004,32(2):e19.)，将上述 基因连接获得融合基因FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb，之后再其3’端引入M 细胞靶向肽分子CO1(Kim S H,Seo K W,Kim J,et al.The M Cell-targeting ligand  promotes antigen delivery and induces antigen-specific immune responses in mucosal  vaccination.J Immunol,2010,185:5787-5795.)、YadA31(序列为 VGLYPAKPILRQENPKLPPRGPQGPEKKRAR，见文献Heise T,Dersch P. Identification of a domain in Yersinia virulence factor YadA that is crucial for  extracellular matrix-specific cell adhesion and uptake.Proc Natl Acad Sci USA.2006， 103(9):3375-80.)以及酶切位点，各基因间由柔性肽GGGGS连接，所获得融合基因 的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

表1 扩增FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31融合基因引物

将SEQ ID NO：3所示的融合基因的PCR产物克隆到载体pMD18-T中，得到 pMD18-FaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31质粒。

优化后基因的获得：根据获得的FaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31序列信息，并对其中的FaeG编码蛋白的第 94位氨基酸残基进行点突变(V→E，对应的密码子由tac变为aac)，目的是增加该 区域的亲水性，将有可能增加蛋白的可溶性表达并提高免疫原性，之后，在不改变 推测蛋白序列的前提下，根据乳酸乳球菌的高频率的密码子结合乳酸乳球菌低 G+C％的特征，适当降低G+C％，并且预置分子内鉴定标签SpeI限制性内切酶位点， 设计了优化后新的mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31融合基因(整 个基因G+C％由优化前的45.20降低为42.04，经网站www.jcat.de在线评估CAI值 由之前的0.26升高为0.98)，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO：l所示。基因由美 国GenScript公司合成，并克隆入pUC57-T质粒，获得重组质粒pUC57-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31。该基因编码的蛋白由ETEC的多价抗原 FaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb与两个靶向肽CO1-YadA31组成，其编码的氨基 酸序列为SEQ ID NO：2所示。基因组织结构示意图如图1所示，点突变之后的亲 水性变化分析见图2。

实施例2制备表达猪ETEC mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31 融合基因的重组乳酸乳球菌

1、重组乳酸乳球菌表达载体的构建与鉴定

利用引物P1：5’-ggtaccggatcctggatgactggtg-3’(下划线标示出酶切位点KpnI、 BamHI)和引物P2:5’-tctagagtcgacttaacaacctttagcagcaaccatg-3’(下划线标示出酶切位 点XbaI、SalI，斜体字母标示终止密码子)，以质粒pUC57-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31作为模板，常规操作PCR扩增得到带有酶切 位点和终止密码子的基因片段mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb，并克隆到载体 pMD18-T中，得到pMD18-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb质粒。利用引物P1： 5’-ggtaccggatcctggatgactggtg-3’和引物P2:5’-tctagagtcgacttatggaagtggtgaac-3’(下划线 标示出酶切位点XbaI、SalI，斜体字母标示终止密码子)，以质粒pUC57-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31作为模板，常规操作PCR扩增得到带有酶切 位点和终止密码子的基因片段mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1，并克隆到 载体pMD18-T中，得到pMD18-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1质粒。

1)将质粒pUC57-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31、 pMD18-FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31、pMD18-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb、pMD18-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1分别进 行限制性内切酶Kpn I和XbaI双酶切。

酶切体系如下：质粒1μg、5μL 10X酶切缓冲液、0.5μL Kpn I、0.5μL XbaI，加 ddH2O补充反应体系至50μL。酶切反应条件为：37℃酶切3小时。

1.0％琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。然后分别对目的片段用柱式胶回收试剂盒 (上海华舜生物工程有限公司)按照说明书的步骤回收约2.0kb左右的融合基因片 段。

2)将含有表达载体质粒pNZ8112的乳酸菌pNZ8112/NZ9000单菌落划板于 GM17固体培养基活化，挑取单个菌落接种于5mL GM17(含5μg/mL Cm)液体培 养基中，30℃静置，厌氧培养过夜，取过夜培养菌液进行质粒的提取，获得pNZ8112 质粒DNA-20℃保存备用。pNZ8112载体图谱如3所示。

将乳酸乳球菌表达载体pNZ8112质粒用限制性内切酶KpnI、XbaI进行双酶切， 酶切体系如下(单位μL)：

1.0％琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，然后对目的片段用柱式胶回收试剂盒(上 海华舜生物工程有限公司)按照说明书的步骤回收约为3.4kb的带有粘性末端的线 性化pNZ8112载体片段。

3)将上述步骤1)、2)中所获得的融合基因片段分别和载体片段进行连接，连 接反应体系如下(单位μL)：

将连接反应体系混匀，置于连接仪中16℃连接过夜；连接产物用于转化乳酸乳 球菌感受态细胞NZ9000。

4)连接产物电转化乳酸乳球菌感受态细胞

电转化用乳酸乳球菌感受态细胞的制备：

挑取新鲜培养的单菌落，接种于5mL GM17+2.5％甘氨酸培养基中，30℃静置 培养过夜；取过夜培养物5mL，用GM17+2.5％甘氨酸培养液稀释至100mL，30℃ 静置培养至OD₆₀₀约0.5；将培养液转移到预冷的50mL离心管中，冰浴10min；4℃， 5000r/min离心10min，弃上清，将沉淀用10mL预冷的电转化缓冲液悬浮；4℃， 5000r/min离心10min，弃上清，再次将沉淀悬浮于10mL预冷的电转化缓冲液；4℃， 5000r/min离心10min，用1mL预冷的电转化缓冲液将沉淀悬浮，分装至1.5ml离心 管，每管100μL。制备好的感受态细胞可以直接使用，也可以-70℃保存待用。

电转化：取制备的电转化感受态细胞，冰上放置5min；每管感受态细胞中加入 步骤3)中的连接产物20μL，轻柔混合后冰浴1min；将感受态细胞和连接产物的混 合物转入2mm的预冷电转化杯中；迅速电击，电击参数为电压2500V；迅速加入 900μL冰预冷的SGM17MC恢复培养基，混匀；将菌液转移至1.5mL离心管中，冰 上放置10min；30℃培养2h；取200μL菌液涂布于含有5μg/mL Cm的GM17琼脂 培养基上，30℃厌氧培养2-3天。

5)阳性重组质粒的筛选、鉴定

于平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/mL氯霉素的GM17液体培养基 中，30℃培养过夜后，从乳酸乳球菌中提取质粒，方法同前。

对重组质粒进行KpnI、XbaI双酶切鉴定。双酶切鉴定的反应体系(单位μL)： 质粒3μL、2μL 10X酶切缓冲液、0.1μL Kpn I、0.1μL XbaI，加ddH20补充反应体系 至20μL。酶切反应条件为：37℃酶切3小时。

反应结束后，取5μL产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，分析结果。经过上述操 作，获得含有重组质粒pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31、 pNZ8112-FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31、pNZ8112-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb、pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1的4 种重组乳酸乳球菌。

6)目的基因在乳酸乳球菌中的表达

挑取含有上述操作中阳性重组质粒的菌落，接种于含有5μg/mL Cm的GM17 液体培养基中，30℃培养过夜后；取过夜培养物0.8mL以1：25比例接种于20mL 含有5μg/mL Cm的GM17液体培养基中，30℃培养至OD₆₀₀为0.4左右；取10mL 细菌培养液用1ng/mL的乳链菌肽Nisin诱导，另外10mL做阴性对照，30℃诱导3h 左右，终止培养后取样做电泳分析。以含质粒pNZ8112的宿主菌NZ9000作为对照。

取诱导后各5mL样品以12000r/min离心3min。分别收集上清和菌体制备 SDS-PAGE样品：菌体用250μLPBS缓冲液悬浮，超声破碎(200W，5min)，加入 250μL 2×SDS凝胶加样缓冲液(含DTT)，充分混匀，煮沸10min，12000r/min离心 3min，取上清20μL上样；取上清样品1mL，加入0.15％脱氧胆酸钠100μL，漩涡 震荡混匀，室温放置10min，加入100μL三氯乙酸(100％)，漩涡震荡混匀，12000r/min 离心15min，弃去上清，用1mL三氯乙酸(10％)重悬沉淀，洗涤一次，12000r/min 离心15min，弃去上清，加入-20℃预冷的丙酮1mL，重悬沉淀，12000r/min离心 15min，弃去上清，沉淀即用作为重组乳酸菌培养上清样品。以蛋白质标准分子量 为参考，在12％SDS-PAGE上进行电泳分析。

SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶放入转印缓冲液中平衡10min。用纯水冲洗半 干电转印仪石墨板，将电极擦干。根据凝胶大小，剪6张Whatman 3mm滤纸和1 张硝酸纤维素膜(大小较凝胶稍小)。将滤纸和硝酸纤维素膜浸于转印缓冲液中， 5min。在阴极方向依次放上3层浸湿的滤纸、转移缓冲液浸泡过的凝胶、硝酸纤维 素膜、3层浸湿的滤纸，确保滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜之间无气泡，将石墨电极 盖在上方，接通电源，0.5-1mA/cm²转印60min。转印结束后，小心取下硝酸纤维素 膜，用纯水冲洗2次，于丽春红染色液(丽春红0.02g，纯水19mL，冰乙酸1mL， 现用现配)中，约1min出现蛋白条带，确定转印的效果。之后，用纯水漂洗至颜 色褪去。

将硝酸纤维素膜放入封闭液(5％脱脂乳的PBS液)中，4℃封闭过夜，0.01mol/L  PBST洗3次，每次5min；将膜移入含有F4阳性血清的第一抗体(刘文鑫，冯瑜 菲，杨旭东，胡文霞，师东方，重组大肠杆菌K88ab和K99蛋白制备的鸡卵黄抗 体的效力评价[J].中国预防兽医学报，2010，32(12)：968-971.)中，37℃摇床孵育 1h，0.01mol/L PBST洗3次，每次5min；将膜移入含有第二抗体(5000倍稀释的 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG)，37℃摇床孵育1h，0.01mol/L PBST洗3次， 每次5min；用0.01mol/L PBS液洗一次，除去Tween-20。将膜浸入10mL 4-氯-1-萘 酚底物显色溶液中显色，5min后观察，水洗终止反应。重组乳酸菌菌体样品和培养 上清样品Western blot结果如图4所示。从图上可以看出，优化前基因FaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31以及优化后基因mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb、mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1、mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31在重组乳酸菌中均有表达，在培养上清和菌 体中均检测到阳性信号，优化前的基因仅能看到微弱的调带，而优化后的基因表达 量明显增加。Western blot鉴定重组乳酸乳球菌证实表达的蛋白保留了天然蛋白的抗 原性。

实施例3制备表达猪ETEC mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31 融合基因的重组大肠杆菌

1、重组大肠杆菌表达载体的构建与鉴定

1)用限制性内切酶BamH I和Sal I(Takara)分别将实施例1得到的 pUC57-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31以及实施2中获得 pMD18-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb、pMD18-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1和pET28a载体(Novagen)分别完全酶切。

酶切体系为：1μg质粒、5μL 10X酶切缓冲液、0.5μL BamH I、0.5μL Sal I，加 ddH20补充反应体系至50μL。酶切反应条件为：37℃酶切3小时。

2)用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用DNA回收试剂盒(上海华舜) 按说明书分别各个回收2kb左右的包含融合基因的片段和5kb左右的pET28a载体 片段，分别溶解于30μL ddH20中。

3)将步骤2)获得的两种片段进行连接反应。连接反应体系为:1μL T4DNA连接 酶，2μL 10×连接酶缓冲液、12μL回收的融合基因的DNA片段、5μL回收的pET28a 载体酶切片段，在16℃连接构建表达质粒。转化至大肠杆菌BL21感受态细胞。筛 选出阳性克隆后，测序验证序列和读码框无误后，诱导表达。获得含有重组质粒 pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31、pET28a-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb、pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1的4 种重组大肠杆菌。

2、重组大肠杆菌诱导表达与鉴定

挑取含上述重组质粒的单克隆菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过 夜。次日以1∶100接种含35mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至 测定OD₆₀₀＝0.4～0.6时，加IPTG至终浓度0.1mmol/L，诱导5h。4℃，5000g离 心5min回收细菌。用蛋白电泳上样缓冲液悬浮菌体后，沸水浴作用5min，用12％ 的分离胶进行SDS-PAGE鉴定。同时设未诱导的受体菌作为对照。取重组菌 pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/BL21诱导后全菌、pET28a-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1/BL21诱导后全菌、重组菌pET28a-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31/BL21诱导后全菌进行SDS-PAGE电泳，得 到图5。从图5可以看出，重组菌pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/BL21 诱导后全菌、重组菌pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1/BL21诱导 后全菌以及重组菌pET28a-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/BL21 诱导后在67kDa处均存一条明显的条带，重组菌pET28a/BL21诱导前后的菌体在 67kDa处没有条带，该结果证明了重组融合蛋白成功获得表达。

蛋白表达存在形式鉴定：取诱导后菌液置于离心管中，4℃4，000g离心l0min， 弃上清，加入1ml 0.lmol/L NaCl，50mmol/L Tris·HCl(pH8.0)的裂解液，在冰浴 下用超声粉碎仪600W输出，4min超声处理五次，将菌体破碎。12,000g离心15min 收集上清液和沉淀，加入等倍体积的SDS-PAGE 2×上样缓冲液，100℃煮沸3min， 10,000g离心5min。取上清液上样进行SDS-PAGE电泳，得到图6。从图6可以看 出，重组融合蛋白以包涵体的形式存在于重组大肠杆菌中。

3、包涵体提取：取大量培养诱导后菌液50mL，4℃5000r/min离心10min，弃 掉上清液，沉淀用4mL的PBS液重悬，之后4℃离心4℃5000r/min离心10min。 重复洗涤一次。弃掉上清，沉淀用1mg/mL溶菌酶4mL重悬，30℃作用15min。观 察作用结果，呈粘稠状后，超声处理30min(功率400w，循环超声3秒，停6秒)， 观察是否变成乳白色，镜检无杆菌形态，即为超声完全。12000r/min离心10min， 弃掉上清液，再按以下步骤对包涵体进行纯化，按每克湿菌3mL的比例加入包涵 体洗涤液Ⅰ重悬沉淀(Tris-Cl 50mmol/L，pH8.0；NaCl 100mmol/L；EDTA 10 mmol/L，pH 8.0；Tri-tonX-1001％)作用1h，4℃8500r/min离心10min，收集沉 淀，加入包涵体洗涤液Ⅱ重悬沉淀(Tris-Cl 50mmol/L，pH 8.0；NaCl 100mmol/L； EDTA 10mmol/L，pH 8.0；TritonX-100.5％)作用1h，4℃8500r/min离心10min， 收集沉淀，加入包涵体洗涤液Ⅲ重悬沉淀(Tris-Cl 50mmol/L，EDTA 10mmol/L，尿 素2mol/L)作用1h，4℃5000r/min离心10min，弃掉上清液，沉淀用4mL的PBS 液重悬，保存备用。提取纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，如图6所示。

4、Western blot鉴定重组大肠杆菌表达的融合蛋白的抗原性

SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶放入转印缓冲液中平衡10min。用纯水冲洗半 干电转印仪石墨板，将电极擦干。根据凝胶大小，剪6张Whatman 3mm滤纸和1 张硝酸纤维素膜(大小较凝胶稍小)。将滤纸和硝酸纤维素膜浸于转印缓冲液中， 5min。在阴极方向依次放上3层浸湿的滤纸、转移缓冲液浸泡过的凝胶、硝酸纤维 素膜、3层浸湿的滤纸，确保滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜之间无气泡，将石墨电极 盖在上方，接通电源，0.5-1mA/cm²转印60min。转印结束后，小心取下硝酸纤维素 膜，用纯水冲洗2次，于丽春红染色液(丽春红0.02g，纯水19mL，冰乙酸1mL， 现用现配)中，约1min出现蛋白条带，有铅笔标出蛋白位置，用纯水漂洗至颜色 褪去。

将硝酸纤维素膜放入封闭液(5％脱脂乳的PBS液)中，4℃封闭过夜，0.01mol/L  PBST洗3次，每次5min；将膜移入含有F4阳性血清的第一抗体(师老师文献) 中，37℃摇床孵育1h，0.01mol/L PBST洗3次，每次5min；将膜移入含有第二抗 体(5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG)，37℃摇床孵育1h，0.01mol/L  PBST洗3次，每次5min；用0.01mol/L PBS液洗一次，除去Tween-20。将膜浸入 10mL 4-氯-1-萘酚底物显色溶液中显色，5min后观察，水洗终止反应。结果如图7 所示。从图7上可以看出目的蛋白获得表达，并且具有良好的免疫反应性。

实施例4以小鼠为模型分析评价重组乳酸乳球菌的免疫原性以及靶向分子的免 疫增强作用

1、试验用疫苗的制备

将实施例2中获得的重组乳酸乳球菌诱导培养至OD₆₀₀值为1.0左右，4500r/min 离心5min，尽弃上清，将收集的菌体用0.01mol/L无菌PBS溶液洗涤一次，4500r/min 离心5min，菌体沉淀用等体积悬浮缓冲液(0.2mol/L NaHCO₃，5％水解酪蛋白，0.5％ 葡萄糖悬浮)，将菌体含量调整到为1×10⁹CFU/mL。

2、实验小鼠分组及免疫

6-8周龄BALB/C鼠40只，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中 心，将实验鼠分成4组，每组10只(全部为雌鼠)。实验A1组每只小鼠口服免疫 200μL pNZ8112/NZ9000(浓度为10⁹CFU/mL)；实验A2组口服同等剂量的 pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/NZ9000；实验A3和A4组口服同等 剂量的pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1/NZ9000、 pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31/NZ9000。免疫程序：分 别在第0天、1天、2天每天口服一次，第13天、14天、15天每天口服加强免疫， 第27天、28天、29天每天口服灌胃第二次加强免疫，共计免疫三次。

3、抗体检测方法

包被抗原及其制备：纯化的F4菌毛：取F4⁺ETEC菌种新鲜培养物1:100接种 于5mL改良Minca液体培养基(KH₂PO₄1.36g、Na₂HPO₄8g、酵母粉1g、酪蛋白 胨5g、甘油5mL、MgSO₄·7H₂O 10mg、MnCl₂·4H₂O 1mg、FeCl₃·6H₂O 0.135g、 CaCl₂·2H₂O 0.4mg，加蒸馏水至1000mL)，37℃振荡培养18h。连续传2代。取第3 代菌体培养物接种于400ml改良Minca液体培养基(两瓶，每瓶200mL)，37℃通 气振荡培养18h。将菌体培养物于4℃，5000r/min离心1min，用15～20mL PBS(0.01mol/L PH 7.4)重悬菌体沉淀，反复洗涤2～3次，用20mL PBS重悬沉淀， 于62℃水浴振30min(离心管浸入水中，用手摇)(该步骤目的为使菌毛脱落)。4℃ 5000rpm离心15min，上清用0.45μm滤膜过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末至终浓度 50％，同时冰浴搅拌2h。(取上清于一无菌摇菌管，向摇菌管中加入一定量硫酸铵 粉末使终含量为50％，将摇菌管置于冰中，在室温摇床上摇2h)。4℃静止过夜(使 K88ab菌毛沉淀)，将摇菌管中的液体及絮状悬浮物分装于无菌EP管中8000rpm， 离心20min。吸弃上清，沉淀物用适量(2～5mL)PBS溶解，4℃透析24h，小量分 装，-20℃保存备用。测定蛋白浓度。

重组菌表达的融合蛋白mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb抗原提取：利用实 施例3所构建的表达mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb的重组大肠杆菌，大量培 养诱导后，按上述步骤提取包涵体后，用GE公司His标签蛋白纯化试剂盒亲和层 析纯化mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb重组蛋白。

重组表达的LTB：利用本发明人实验室前期所构建的表达LTB的重组大肠杆菌 (葛俊伟，姜艳平，杨敏，哈卓，乔薪瑗，唐丽杰，李一经,大肠杆菌不耐热肠毒 素B亚单位在大肠杆菌中的表达及其特性研究.东北农业大学学报，2010，41(6): 109～112)，大量培养诱导后，按上述步骤提取包涵体后，用GE公司His标签蛋白 纯化试剂盒亲和层析纯化LTB重组蛋白。

免疫小鼠血清中抗F4、LTB以及mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋 白特异性IgG抗体测定：分别在免疫前、初次免疫后第10d、24d、38d采集免疫小 鼠血液，分离血清，-80℃保存备用。将纯化的蛋白作为抗原包被96孔ELISA反 应板，(纯化的大肠杆菌F4菌毛(4μg/孔)或纯化的大肠杆菌表达的FaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb重组蛋白(2μg/孔)或纯化的大肠杆菌表达的LTB重组蛋 白(1μg/孔))，4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min；每孔加入200μL 5％脱 脂乳，37℃封闭2h，PBST洗涤3次；分别加入稀释的小鼠血清(1：400稀释)， 37℃作用1h，PBST洗涤3次。加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，37℃ 作用1h，PBST洗涤3次；加入OPD-H₂O₂显色液，37℃避光显色15min，加终止 液后，用酶标测定仪在波长490nm处测定每孔的光吸收(OD490)值。重组乳酸菌 免疫后血清特异性IgG检测结果如图8所示。从图上可以看出，用重组乳酸菌口服 免疫一次，10d后即可产生免疫应答，可检测到特异性IgG抗体出现，并且随着免 疫次数的增加，抗体水平也在逐步增加，单靶向分子CO1可明显提高重组乳酸菌的 免疫效果，双靶向分子CO1、YadA31可进一步提高抗体的产生，提高免疫应答水 平，差异显著。用不同的抗原检测抗体的结果显示，针对F4、LTB以及mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋白的特异性抗体的趋势基本一致，说明融合蛋白之 间的GGGGS连接肽正常发挥功能，各个抗原相互之间不影响免疫活性。

免疫小鼠粪便中抗F4、LTB以及FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋白 特异性sIgA测定：分别在免疫前第0d和免疫后的第3、7、10、14、18、21、24、 28、31、34、38、42、45d采集免疫小鼠粪便，每0.1g粪便加入0.5mL提取液(PBS 中加入100mM EDTA-Na₂)，振荡45min，10000r/min离心10min，收集上清。

重组乳酸菌免疫后粪便中抗F4、LTB以及mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb 融合蛋白的sIgA检测结果如图9-图11所示。从图上可以看出，用重组乳酸菌口服 免疫7d后即产生黏膜免疫应答，可检测到特异性sIgA抗体出现，第二次免疫后4d, 抗体水平升高到最高峰，第三次免疫后，特异性sIgA抗体进一步升高，在第34-38 天左右sIgA抗体达到峰值，之后抗体水平逐渐缓慢下降，到45天检测结束仍保持 有较高水平的抗体。单靶向分子CO1可提高重组乳酸菌的免疫效果，双靶向分子 CO1、YadA31可进一步提高抗体的产生，提高免疫应答水平，差异显著。用不同的 抗原检测抗体的结果显示，针对F4、LTB以及mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb 融合蛋白的特异性抗体的趋势也基本一致，也说明融合蛋白之间不影响免疫活性。

4、脾淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测

各组在三免后10天(38d)取4只小鼠，迫杀，无菌取脾脏，制备成单个脾细 胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清液，加入10mL 8.3moL/L Tris-NH₄Cl，37℃ 水浴5min使红细胞裂解后1000r/min离心10min，弃上清液，加入适量Hank’s缓 冲液洗涤3次，每次1000r/min离心10min，弃上清液，进行细胞计数，调整细胞 浓度为1×10⁷个/mL，每孔加入100μL。刺激时采用两个抗原浓度，每个样本8个重 复，同时设阴性对照。阳性对照试验孔加入ConA，终浓度为5μg/mL。置37℃，5％ 的CO₂培养箱培养72h后，每个样本吸出4孔用于测定细胞因子，其余各孔每孔加 入5mg/mL MTT 10μL，继续培养3h。然后每孔加100μL终止液(含0.04mol/L HCl、 l0％SDS)，测定OD₅₇₀吸光值。计算刺激指数(SI)＝试验孔OD₅₇₀吸光值/阴性对照 孔OD₅₇₀吸光值。

结果显示，对照组淋巴细胞增殖不明显，其SI值均低于1.2。重组乳酸菌 pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/NZ9000组脾淋巴细胞，在5μg/mL 抗原和1μg/mL抗原不同浓度刺激的下，小鼠淋巴细胞增殖刺激指数分别为 1.44±0.14、1.31±0.14，显著高于免疫对照组的1.120±0.131(P<0.01)、1.000±0.014 (P<0.05)；pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1/NZ9000组免疫组在相 同条件下，刺激指数分别为1.574±0.402、1.963±0.856，后者显著高于 pNZ8112/NZ9000组免疫对照组；pNZ8112-mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31/NZ9000组在相同条件下，刺激指数分别为 2.035±0.479、1.910±0.822，显著高于免疫对照组的1.120±0.131(P<0.01)、1.000±0.014 (P<0.05)，也显著高于pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1/NZ9000组 (P<0.05)，提示双靶向分子免疫组产生了比单靶向免疫组更强的细胞免疫反应。

结果证明，口服重组乳酸杆菌能够诱导机体产生特异性细胞免疫应答。

上述培养液中IFN-γ、IL-4水平采用BioSource ELISA试剂盒检测，按说明书操 作，分别以标准品绘制标准曲线，计算待检测样品中相应细胞因子的含量。结果显 示IL-4、IFN均有不同程度升高，虽然数值较低但均明显高于对照组(p<0.01)。 试验鼠脾细胞在体外经抗原再次刺激下分泌细胞因子的结果表明，重组乳酸菌免疫 鼠脾细胞培养上清中IL-4和IFN-γ分泌水平明显高于对照鼠(p<0.01)。各个免疫 组IL-4和IFN-γ比值均表现为IL-4和IFN-γ比值大于1，这些数据上可证实在机体 免疫应答中起主导作用的免疫反应类型以Th2型免疫应答为主，Th1和Th2型免疫 反应平衡增高的应答模式。鉴于在实验中免疫小鼠的脾细胞培养上清中代表Th1亚 型的IFN-γ和代表Th2亚型的IL-4均有较大程度的提高，可以确定重组菌能够诱导 Thl和Th2型免疫应答。结果如下表2所示。

表2 细胞因子检测结果

注^＊＊表示差异极显著

以上结果充分证实，用本发明制备的重组乳酸菌免疫动物，具有良好的免疫原 性，口服免疫模式动物小鼠可以诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，也可产 生局部黏膜免疫应答。单、双靶向分子都具有提高免疫效果的作用。本发明制备的 重组乳酸菌可以作为基因工程活载体疫苗使用。

实施例5以小鼠为模型分析评价重组大肠杆菌表达的包涵体蛋白的免疫原性 测定试验以及靶向分子免疫增强作用的验证试验

1、试验用疫苗的制备

根据实施例3中大量制备重组大肠杆菌表达的包涵体蛋白，使用SDS-PAGE鉴 定纯度，并使用蛋白定量试剂盒(Bio-RAD)测定蛋白浓度。

2、抗体检测方法

包被抗原及其制备、纯化的F4菌毛、重组表达的LTB、重组表达的融合蛋白 mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31如实施例4所述。

以纯化的蛋白(纯化的F4菌毛、重组表达的LTB、重组表达的融合蛋白 mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31)作为抗原包被96孔ELISA反应 板，4℃包被过夜；用含有5％脱脂乳的PBS液37℃封闭2h；分别加入处理好的样 品，37℃反应1h；加入1：2000稀释的HRP标记羊抗鼠猪IgA二抗或HRP标记羊 抗鼠IgG二抗(sigma)，37℃反应1h；加OPD-H₂O₂底物显色液，37℃避光显色15min， 加终止液后，酶标测定仪在波长490nm处测定每孔的光吸收(OD490)值。

3、试验小鼠免疫与抗体检测

根据实施例3中大量制备重组大肠杆菌表达的包涵体蛋白，使用SDS-PAGE鉴 定纯度，并使用蛋白定量试剂盒(Bio-RAD)测定蛋白浓度。

6-8周龄BALB/C鼠40只，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中 心，将实验鼠分成4组，每组10只(全部为雌鼠)。标记为B1-B4，每组5头。B1 组设为攻毒对照组，不免疫只攻毒；B2组口服免疫大肠杆菌表达的mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb包涵体疫苗，40μg/只；B3组口服免疫大肠杆菌表达的 mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1包涵体疫苗(单靶向)，40μg/只；B4组口 服免疫大肠杆菌表达的mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-co1-YadA31包涵体疫 苗(双靶向)，40μg/只。免疫程序：免疫3次，每次间隔两周，即在第0天、第14 天、第28天各免疫一次。

样品采集与处理：分别于0天、10天、24天、38天收集免疫小鼠新鲜粪便、 血液等样品。新鲜粪便-70℃冻存备用。采集免疫小鼠血液后，分离血清，-70℃冻 存备用。

粪便样品处理：将每0.1g粪便加入0.5mL提取液，置于振荡器上，振荡30min， 4℃放置过夜，10000r/mim离心5min，收集上清用作检测样品。

采用ELISA方法检测血清中抗F4、LTB以及mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋白抗体水平，结果见图12。从图中看出，抗原免疫 组试验小鼠在两次免疫后均可产生明显的抗体，抗F4、LTB以及mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋白抗体增加趋势基本一致，单靶向分子CO1可提高 融合抗原的免疫效果，双靶向分子CO1、YadA31可进一步提高抗体的产生，此结 果表明，本发明采用重组大肠杆菌表达密码子优化的ETEC多价抗原蛋白基因得到 的包涵体蛋白具有良好的免疫原性，制备的疫苗，免疫小鼠后，可诱导产生体液免 疫应答。同时，也证实，GGGGS linker连接肽可以使各个抗原发挥各自的功能， 相互之间不影响免疫效果。

重组大肠杆菌表达的包涵体疫苗免疫小鼠后粪便中抗F4、LTB以及mFaeG-F18 RBD-Stx2e-STa-LTB-STb融合蛋白的sIgA抗体水平动态检测结果如图13-15所示。 经两次免疫后，小鼠在接种后16天已出现特异性sIgA抗体，随后抗体水平逐渐升 高，到20天左右sIgA抗体达到高峰，第三次免疫后，特异性sIgA抗体进一步升高， 在第36天左右sIgA抗体达到峰值，之后在38天攻毒后抗体进一步提高，说明免疫 鼠产生了免疫记忆效应。

为进一步评价免疫书产生的免疫应答，本发明在测定抗体的基础上，用ETEC (cvcc196，F4⁺LT⁺ST⁺)10⁹CFU/只小鼠的剂量口服攻毒，检测攻毒后小鼠的发病情 况以及从粪便中排菌的情况。包涵体免疫小鼠后用ETEC攻毒后粪便中排除细菌情 况如图16所示。B1对照组出现明显的腹泻症状，并且有2只小鼠死亡，粪便中排 菌时间平均为11天，B2免疫组试验小鼠平均排菌时间明显缩短至7天，而融合抗 原单靶向免疫组试验小鼠平均排菌时间明显缩短至5天，融合抗原双靶向免疫组则 排菌时间平均仅为3天。

以上结果充分证实，用本发明制备的重组大肠杆菌表达所的包涵体作为活性成 分免疫动物，具有良好的免疫原性，可以诱导模式动物小鼠产生免疫应答，单、双 靶向分子都具有提高免疫效果的作用，可以作为基因工程亚单位疫苗使用。

实施例6以重组大肠杆菌表达的包涵体蛋白为活性成分的基因工程亚单位疫 苗以及重组乳酸乳球菌作为基因工程活载体的猪免疫保护试验

1、试验用疫苗的制备

根据实施例3中大量制备重组大肠杆菌表达的包涵体蛋白，使用SDS-PAGE鉴 定纯度，并使用蛋白定量试剂盒(Bio-RAD)测定蛋白浓度。

根据实施例2中将重组乳酸乳球菌培养至OD₆₀₀值为1.0左右，4500r/min离心 5min，尽弃上清，将收集的菌体用0.01mol/L无菌PBS溶液洗涤一次，4500r/min 离心5min，菌体沉淀用等体积悬浮缓冲液(0.2mol/L NaHCO₃，5％水解酪蛋白，0.5％ 葡萄糖悬浮)，使细菌含量为1×10¹⁰CFU/mL。

2、抗体检测方法

包被抗原及其制备、纯化的F4菌毛、重组表达的LTB以及重组表达的融合蛋 白mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31如实施例4所述。

以纯化的蛋白(纯化的F4菌毛、重组表达的LTB、重组表达的融合蛋白 mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-CO1-YadA31)作为抗原包被96孔ELISA反应 板，4℃包被过夜；用含有5％脱脂乳的PBS液37℃封闭2h；分别加入处理好的样 品，37℃反应1h；加入1：2000稀释的HRP标记羊抗猪IgA二抗或HRP标记羊抗 猪IgG二抗(sigma)，37℃反应1h；加OPD-H₂O₂底物显色液，37℃避光显色15min， 加终止液后，酶标测定仪在波长490nm处测定每孔的光吸收(OD490)值。

3、试验猪的筛选

挑选20日龄健康仔猪32头，试验前利用ELISA检测试剂盒检测F4、F18抗体， 同时利用采集粪便采用细菌分离方法分离F4⁺、F18⁺ETEC，确保每头试验猪为抗原、 抗体双阴性。

4、试验猪免疫与抗体检测

将抗原、抗体双阴性的试验猪随机分为5个组，标记为G1-H7，每组5头。 G1组设为空白对照组，不免疫不攻毒；G2组设为攻毒对照组，不免疫只攻毒；G3 组滴鼻免疫大肠杆菌表达的包涵体疫苗，100μg/头；G4组口服免疫大肠杆菌表达的 包涵体疫苗，4mg/头；G5组肌肉注射免疫大肠杆菌表达的包涵体疫苗，100μg/头； G6组口服免疫重组乳酸乳球菌作为活载体的基因工程疫苗，l0¹⁰CFU/头；G7组滴 鼻免疫重组乳酸乳球菌作为活载体的基因工程疫苗，l0¹⁰CFU/头(表3)。大肠杆菌 表达的包涵体疫苗免疫程序：免疫2次，首免免疫时间为20日龄，30日龄二免； 重组乳酸乳球菌活载体基因工程疫苗免疫程序：免疫2次，每次连续免疫3d，每天 1次，首免免疫时间为20日龄，30日龄二免。

表3 免疫分组表

组别 免疫抗原 免疫剂量 免疫途径 猪数量 G1 空白对照组(不免疫不攻毒) - - 4头 G2 PBS对照组(不免疫只攻毒) - - 5头 G3 包涵体滴鼻组 100μg/头 滴鼻 5头 G4 包涵体口服组 4mg/头 口服 5头 G5 包涵体肌肉注射组 100μg/头 肌肉注射 5头 G6 乳酸菌口服组 l0¹⁰CFU/头 口服 5头 G7 乳酸菌滴鼻组 l0¹⁰CFU/头 滴鼻 5头

样品采集与处理：首次免疫21天后，收集试验猪新鲜粪便、血液等样品。新 鲜粪便-70℃冻存备用。采集试验猪血液后，分离血清，-70℃冻存备用。

粪便样品处理：检测前，将每0.1g粪便加入0.5mL提取液，置于振荡器上，振 荡30min，4℃放置过夜，10000r/mim离心5min，收集上清用作检测样品测定特异 性sIgA抗体。

采用ELISA方法检测血清IgG、粪便sIgA抗体水平，结果见图17、18。从图 中看出，G3-G7组试验猪均可产生明显的血清IgG、黏膜sIgA抗体，其中尤以重组 乳酸菌经鼻免疫效果最好。此结果表明，本发明采用重组大肠杆菌表达密码子优化 的ETEC多价抗原蛋白基因得到的包涵体蛋白以及重组乳酸菌具有良好的免疫原 性，制备的疫苗，免疫仔猪后，可以产生特异性的系统免疫应答和及局部黏膜免疫 应答。

5、试验猪攻毒

用ELISA方法检测IgG、sIgA抗体可以反映免疫后在接种猪鼠体内诱导免疫应 答的整体水平，而更直观也更为确实的的保护性免疫指标是攻毒后的免疫保护作 用。因此，在检测检测IgG、sIgA抗体的同时，本发明也测定了G2-G7实验组攻毒 后的免疫保护情况。步骤如下：在步骤4免疫后24日，在G2-G7组试验猪每头先 灌胃62mL 1.6％NaHCO₃，30min后，口服饲喂新鲜培养的F4⁺(cvcc196， F4⁺LT⁺STb⁺)、F18⁺(临床分离株，F18⁺Stx2e⁺STa⁺)ETEC菌株各l0¹⁰CFU/头， 每头猪攻毒的细菌总数为2×l0¹⁰CFU。

G1为空白对照，不免疫不攻毒，隔离饲养。观察期结束，扑杀剖检。

根据各组试验猪的临床症状、腹泻情况、增重、肠道炎性因子表达水平等指标 对疫苗的免疫效力进行判定。攻毒后，只有G2组出现明显的腹泻症状，猪只精神 沉郁，不愿活动，采食饮水下降，其他组未见明显异常。

攻毒后试验猪平均日增重见图19。从图19可以看出，G2组(不免疫只攻毒对 照组)试验猪在攻毒后平均日增重明显降低，而免疫疫苗的试验组攻毒后平均日增重 明显高于G2组，差异极显著，而G3、G4、G5免疫疫苗的试验组攻毒后平均日增 重与G1组(不免疫不攻毒对照组)之间差异不显著；与免疫其他的疫苗的仔猪相比， 乳酸菌活载体疫苗口服免疫的仔猪攻毒后平均日增重较高，与G1组(不免疫不攻毒 对照组)之间差异显著，说明免疫乳酸菌活载体疫苗可以提高和改善试验猪攻毒后的 平均日增重。

试验猪攻毒后，粪便排毒检测结果见图20。从图20可以看出，试验猪攻毒后， 连续采集粪便样品，检测粪便中采用细菌分离方法分离F4⁺、F18⁺ETEC，G2组平 均排菌时间为8天，G3-G7组平均排菌时间均明显缩短，证实疫苗免疫后产生的免 疫应答可以缩短感染猪的排毒时间，对减少猪场内感染机会，猪群快速恢复健康状 态具有重要意义。

上述结果说明，免疫采用本发明制备的疫苗，能够有效的保护仔猪抵抗至少2 ×10¹⁰CFU ETEC攻击。