滋养细胞p38--Wip1反馈通路异常诱导子痫前期发生机制研究

摘要

研究背景和目的：滋养细胞功能异常是引起子痫前期的重要因素，目前滋养细胞功能的调控机制尚未完全阐明。滋养细胞因持续缺氧所导致的过度凋亡可影响胎盘形成过程，进而诱发包括子痫前期（Preeclampsia，PE）在内的多种妊娠相关疾病。野生型p53诱导磷酸酶（Wild-type p53-induced phosphatase，Wip1）可通过p38和p53途径正向调控肿瘤细胞生存，但其在滋养细胞中的表达方式及调控作用目前尚无报道。本课题将探讨Wip1通过p53依赖途径调控滋养细胞凋亡具体机制，以期为子痫前期发病机制提供新的研究方向。　　方法：WB和RT-qPCR分别检测正常与PE胎盘组织中Wip1蛋白和mRNA水平；免疫组化和免疫荧光分别检测胎盘组织和HTR8/SVneo细胞中Wip1的表达定位；运用物理和化学方法构建两种滋养细胞体外缺氧模型，并使用Wip1特异性抑制剂GSK2830371和慢病毒包被短发夹RNA（shRNA）分别抑制Wip1酶活性和表达后，通过流式细胞术检测细胞凋亡水平变化，同时WB检测cleaved-caspase 9等凋亡相关分子以进一步验证。单独或联合运用p38、Mdm2和蛋白酶体特异性抑制剂处理细胞模型以检测反馈通路中各信号分子的相互作用；通过免疫共沉淀检测Wip1对Mdm2-p53互作的调控作用；最后，WB验证胎盘组织中各信号分子的表达情况。　　结果：Wip1在PE胎盘和PE细胞模型中均显著上调，药物抑制Wip1活性和慢病毒敲降Wip1后均可部分逆转缺氧所诱导的p38磷酸化、cleaved-caspase 9和细胞凋亡水平，同时促进p53在Ser15位点的磷酸化，并抑制Mdm2-p53结合。Mdm2降解受到抑制后可导致p53失稳态，并抑制p38-Wip1反馈途径；Mdm2-p53互作减少可使p53累积并激活p38-Wip1反馈途径。参与调控滋养细胞p38-Wip1反馈通路的调节因素中，Mdm2-p53的互作过程比Mdm2的稳态发挥着更为重要的作用。　　结论：缺氧应激状态下，滋养细胞通过p38-Wip1反馈途径来维持p53稳态，当该反馈途径发生紊乱时可引起滋养细胞过度凋亡，进而诱发PE发生。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 Wip1在胎盘和细胞模型中表达及对细胞凋亡的调控作用

1 材料与方法

1.1招募研究对象

1.2 样本采集

1.3主要试剂

1.4主要仪器

1.5 免疫组化

1.6构建体外模型

1.7 免疫印迹

1.8免疫荧光

1.9 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

1.10 构建Wip1敲降细胞株

1.11流式检测细胞凋亡

1.12数据分析

2结果

2.1采集对象的临床信息

2.2 胎盘组织中Wip1主要表达于滋养细胞

2.3 Wip1在PE胎盘和体外细胞模型中高表达

2.4 抑制Wip1可降低HTR8/SVneo细胞因缺氧所致的凋亡水平

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 Wip1调控滋养细胞凋亡机制

1材料与方法

1.1胎盘组织

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4免疫共沉淀

1.5免疫印迹

2结果

2.1 缺氧条件下Wip1可激活滋养细胞p38，并使p53在Ser15位点去磷酸化

2.2 Wip1调控滋养细胞Mdm2-p53相互作用

2.3 p38调节依赖Mdm2的p53降解途径，可诱导Wip1表达

2.4抑制Mdm2降解后可导致p53失稳态，并抑制p38-Wip1反馈通路

2.5抑制Mdm-p53结合可上调p53，并激活p38-Wip1反馈通路

2.6 滋养细胞中Wip1是p53的下游效应分子

2.7 Mdm2-p53互作是p38-Wip1反馈通路的必要环节

2.8 与Mdm2稳态相比，Mdm2-p53互作在p38-Wip1反馈通路中起着更重要的调控作用

2.9 p38-Wip1反馈通路在PE胎盘中激活

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述:胎盘缺氧与子痫前期

致谢

攻读学位期间发表的学术论文