蛹虫草液体发酵及其活性提取物对小鼠肠道和生理的影响研究

摘要

蛹虫草隶属于真菌界、真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、肉座菌目、麦角菌科，与冬虫夏草同属不同种。因富含虫草素、腺苷、虫草多糖和虫草酸等生理活性物质，具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗白血病、降血糖、降血脂等生理作用，被人们关注并研究。目前市面上的产品主要以子实体为主，子实体在长期的保存过程中面临着营养成分和有效成分流失的问题。而蛹虫草的液态发酵，生产周期短，易于自动化控制，发酵液中有效成分丰富。对蛹虫草菌丝体及发酵液中有效成分的提取及其深加工，可以提高蛹虫草活性成分的保存和机体的吸收。越来越多的研究发现肠道菌群与机体的健康有着密不可分的联系，本研究从蛹虫草菌种出发通过发酵、提取活性成分，然后以小鼠为动物模型，探究蛹虫草对肠道微生物的影响。本论文主要研究内容如下：　　1、对蛹虫草液态发酵培养基及条件优化。通过单因素实验和正交实验，得出最优培养基为：D-果糖4%、牛肉膏1.5%、氯化钙0.1%，VB1 10mg/L；发酵条件为：发酵时间9天，温度25 ℃，转速为120 r/min，初始pH为5，装液量为100 ml，接种量为10%。最后验证优化结果，蛹虫草菌丝体发酵高达18.838 g/L。　　2、对菌丝体中活性成分提取工艺优化，确定提取工艺条件：温度为100 ℃，料液比为1∶20，提取3 h，多糖提取率高达10.56%。将浸提液与抽提后的发酵液混合采用复合酶(纤维素酶和半纤维素酶各2万U/g多糖)进行虫草多糖水解，在pH 4.5、反应温度45℃下酶解90 min时寡糖生成量最高。经过离心（转速10000 r/min、进料量4 L/min）分离可有效获得较为澄清的发酵液。采用超滤膜和纳滤膜过滤有效物质的收率较高，其中超滤条件为：压力2 MPa，流量60 L/h；纳滤条件为：压力3 MPa，流量30 L/h。最后在温度55℃，真空度0.08条件下浓缩使得物料干物质浓度达180 g/L，喷干获得的粉剂颗粒均匀、含水量较低，喷干操作参数：进风温度140 ℃，出风温度85 ℃。　　3、蛹虫草菌粉对小鼠肠道及生理的影响研究。构建肠道菌群紊乱模型小鼠，造模成功后，给药不同剂量的蛹虫草提取物，并以水、低聚甘露糖和正常为对照组，给药时间一个月。对小鼠实验阶段体重和进食量进行记录，发现给药组小鼠体重与对照组相比明显减轻。在每一个时间节点对小鼠采集粪便、稀释涂布，分别考察肠杆菌、肠球菌、乳杆菌、双歧杆菌的活菌变化情况，结果显示蛹虫草提取物对粪便中活菌数有一定的调节作用。给药结束后取小鼠血清进行检测，发现蛹虫草提取物有改善血脂、保护肝脏及心脏的作用。取小鼠粪便、结肠内容物、回肠内容物，提取总DNA进行16S rDNA测序分析，分析发现蛹虫草提取物对肠道菌群的丰度、多样性和肥胖有关的菌群有一定的调节能力。

目录

1 绪 论

1.1 蛹虫草简介

1.2 蛹虫草的人工培养

1.2.1 固态培养

1.2.2 液态培养

1.3.1 核苷类物质

1.3.2 虫草多糖

1.3.3 虫草酸

1.3.4 其他活性物质

1.4.1 抗肿瘤

1.4.2 抑菌、抗氧化

1.4.3 免疫调节

1.4.4 降血糖血脂

1.4.5 其他生理作用

1.5 研究目的与意义

1.6 研究内容

2 蛹虫草液体发酵条件的优化

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验药品和试剂

2.2.2 实验仪器

2.2.3 发酵培养基优化

2.2.4 发酵条件优化

2.3 结果与分析

2.3.1 培养基优化结果

2.3.2 发酵条件优化

2.4 本章小结

3 蛹虫草活性物质提取制粉工艺研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 材料与试剂

3.2.2 实验仪器

3.2.3 水热浸提法的优化

3.2.4 粗多糖酶解工艺

3.2.5 离心与过滤工艺

3.2.6 发酵液喷雾干燥制粉

3.3 检测

3.3.1 DNS法测还原糖

3.3.2苯酚硫酸法测总糖

3.3.3 目标成分的检测

3.4.1 DNS法测还原糖

3.4.2 苯酚-硫酸法标准曲线

3.4.3 水热法对蛹虫草菌丝体提取的优化

3.4.4 酶解工艺

3.4.5 离心过滤与制粉

3.5 本章小结

4 蛹虫草提取物对小鼠肠道及生理的影响

4.1 引言

4.2.1 实验试剂及仪器

4.2.2 动物分组和给药

4.2.3 生理指标检测

4.2.4 粪便样本的采集与活菌计数

4.2.5 小鼠粪便及肠道内容物DNA的提取

4.2.6 PCR扩增与测序

4.3 结果与分析

4.3.1 蛹虫草活性提取物对小鼠体重和进食量的影响

4.3.2 小鼠血清生化指标

4.3.3 小鼠粪便的活菌计数

4.3.4 小鼠粪便及肠道微生物PCR扩增

4.3.5 小鼠粪便及肠道菌群稀释曲线及多样性曲线分析

4.3.6 小鼠粪便及肠道微生物Alpha多样性分析

4.3.7 小鼠粪便及肠道菌群的文氏图

4.3.8 小鼠粪便及肠道群落结构分析

4.4 本章小结

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

附录

A. 活菌计数对数数据

B. 学位论文数据集

致谢