TIGR调控合成L-哌啶甲酸的代谢工程研究

摘要

石油资源的缺乏和日益增加的环境问题迫切需要一种可再生，无金属污染，可持续和绿色的生物制造方法。生物质衍生化学品价值链的潜力对于培育这样一个新兴的生物基工业至关重要。论文构建了一株以赖氨酸为底物通过生物发酵来合成手性药物中间体哌啶甲酸表达外源基因的大肠杆菌，该方法相对简洁和高效。化学合成往往得不到纯手性的哌啶甲酸还需要进行外消旋体拆分，而生物合成一步法即可得到L-哌啶甲酸。为进一步提高L-哌啶甲酸的产量，我们选择已经敲除了赖氨酸降解酶（CadA）的大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌，采用Raip, GDH, Dpka, LysP四个基因串联表达，可得到L-哌啶甲酸浓度为30 g/L。液质联用结果表明发酵液中还存在大量的中间产物△1-哌啶-2-羧酸。　　为减少中间产物的积累，我们在基因Dpka，GDH起始密码子前分别设计四种不同的重复序列(A)16、(C)16、(AC)8和(AT)8可得到16种不同组合的基因间隔序列（TIGR）。以ptrc99a为载体将含TIGR间隔序列分别连接到GDH和Dpka上，与能表达脱氨环化酶rAIP以及能够表达赖氨酸通透酶的 LysR以不同的组合进行串联表达以加强该微生物代谢的过程。这种生产 L-哌啶酸的生物技术是一种简单，经济，绿色的技术，可以替代现有的化学合成。此外，生物质衍生的赖氨酸工业可以扩大到更大的规模，研究表明具有扩展价值链的生物质衍生化学品的更好前景。　　通过研究底物种类对生产L-哌啶甲酸的影响，确定L-赖氨酸HCl作为生产L-哌啶甲酸的更优底物，可提高L-哌啶甲酸产量21.28%，可节约发酵成本16.67%。对赖氨酸降解途径中的关键酶CadA进行了敲除和过表达赖氨酸转运蛋白酶LysP，加强赖氨酸转运速率，分别可提高L-哌啶甲酸产量52.52%和49.88%。最后5-L发酵罐发酵40h可生产46.7 g/L L-哌啶甲酸，得率为0.89 g/g。　　本论文的创新之处为在国际上首次将TIGR引入到Dpka, GDH基因中，减少的中间产物的积累，极大地优化了 L-哌啶甲酸的代谢途径，同时通过优化大肠杆菌密码子敲除哌啶甲酸降解途径等等，有利于减少间歇发酵空时，提高了有效劳动效率。

目录

1 绪 论

1.1 L-哌啶甲酸的市场概况与用途

1.2.1 化学与酶耦合合成

1.2.2 生物合成

1.2.3 多基因途径

1.3 间隔序列调控的原理

1.4.1 研究意义

1.4.2 研究内容

2 材料和方法

2.1.1 菌种

2.1.2 主要药品和试剂的配制方法

2.1.3 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 培养基配制方法

2.2.2 菌种的活化与保藏

2.2.3 分子常规实验方法

2.2.4 基因敲除

2.3 载体构建

2.3.1 构建重组质粒HYD-01

2.3.2 构建重组质粒HYD-02

2.3.3 构建重组质粒HYD-03

2.3.4 构建重组质粒HYD-04

2.4 L-哌啶甲酸检测方法

2.4.1 检测仪器的设置及参数

2.5 L-lysine检测方法

① 溶液的配制

② L-lysine 标准曲线绘制 标准曲线绘制

2.6 DNS法测葡萄糖标准曲线

2.7 样品预处理

3 结果与讨论

3.1 工程菌株HYD03和HYD04的构建

3.2 发酵水平合成L-哌啶甲酸

3.2.1 底物对L-哌啶甲酸合成的影响

3.2.2 细胞密度对L-哌啶甲酸合成的影响

3.2.3 建立库TIGR库HYD1-HYD4

3.2.4 摇瓶发酵对TIGR库进行筛选

3.2.5 基因敲除对哌啶甲酸生产的影响

4 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

附录

A 作者在攻读学位期间发表和已完成的论文

B 学位论文数据集

致谢