Ferritin@HSA-RSL3复合蛋白药物传输系统的构建及其靶向诱导乳腺癌细胞铁死亡的研究

摘要

癌症是目前对人类健康威胁最大的疾病之一，乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）在女性中的发病率和致死率均位居前列，在传统治疗手段单一，治疗效果和预后情况都不理想的情况下，急需根据 TNBC 的特点设计新型的治疗方案。在本文中，根据TNBC中的MDA-MB-231细胞系的一些特点，设计出一种新型的基于人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）和铁蛋白（Ferritin）的复合蛋白纳米药物递送载体——Ferritin@HSA-RSL3复合蛋白纳米颗粒，这两种人源性的蛋白质具有良好的生物相容性和生物可降解性，HSA 可以装载RSL3这种诱导铁死亡的小分子药物，同时还能提供氨基与铁蛋白相互交联形成纳米颗粒，另外也可以增加纳米颗粒在血液中的循环时间，避免被巨噬细胞吞噬，Ferritin 可以通过与肿瘤细胞表面高表达的 TFR1 受体特异性结合实现纳米递送载体对MDA-MB-231细胞的精确靶向，同时Ferritin被细胞内溶酶体降解释放的铁会进一步和脂质过氧化物结合形成脂质活性氧（Lipid Radical）从而破坏溶酶体，进一步释放出RSL3和Fe，Ferritin和RSL3协同作用共同促进肿瘤细胞的铁死亡并达到 1+1>2 的效果。同时本文探索了一系列的复合蛋白纳米颗粒的合成条件和两种蛋白比例的优化，最终确定了两种蛋白之间最优的交联比例为HSA:Ferritin 为 8:2，在本文中，通过透射电镜和动态光散射等仪器表征了复合蛋白纳米颗粒的形貌和粒径特点，同时通过后续的体外实验，如细胞吞噬，细胞内脂质活性氧水平的检测，细胞铁死亡效果等实验进行了验证，证明了复合蛋白纳米颗粒可以有效的靶向到MDA-MB-231细胞并诱导细胞发生铁死亡的能力。该论文通过不同种蛋白相互交联并负载铁死亡诱导剂的设计理念为后续符合蛋白纳米药物传输系统的制备以及临床应用提供借鉴和新策略。

目录

1 绪 论

1.1 引言

1.2.1乳腺癌

1.2.2 三阴性乳腺癌

1.3目前癌症的趋势和诊疗策略，局限性以及未来的治疗方式

1.4生物纳米材料的应用，前景和局限，以及蛋白质生物纳米材料的优势和应用

1.4.1 人血清白蛋白

1.4.2铁元素的作用及铁代谢与癌症的关系

1.4.3铁蛋白

1.5铁死亡

1.6 RSL3概述

1.7研究目的和意义

1.8 本文研究内容

1.9论文创新点

2 复合蛋白纳米颗粒的制备与表征

2.1前言

2.2.1实验试剂

2.2.2实验仪器

2.3实验方法

2.3.1白蛋白装载RSL3

2.3.2白蛋白纳米颗粒的制备

2.3.4铁蛋白纳米颗粒的制备

2.3.5 Ferritin@HSA复合蛋白纳米颗粒的制备

2.3.6 Ferritin@HSA-RSL3复合蛋白纳米颗粒的制备

2.3.7 DLS 表征蛋白纳米颗粒的粒径分布以及分散性

2.3.8 HSA蛋白颗粒和Ferritin@HSA蛋白颗粒接FITC荧光标记分子

2.3.9 HSA-RSL3白蛋白纳米颗粒和Ferritin@HSA-RLS3复合蛋白纳米颗粒载药率的测量

2.3.10 HSA蛋白颗粒和Ferritin@HSA蛋白颗粒接FITC荧光标记分子荧光强度的测定

2.4 实验结果及讨论

2.4.1 HSA-RSL3蛋白纳米颗粒的表征

2.4.2 Ferritin@HSA蛋白纳米颗粒的表征

2.4.3 Ferritin@HSA-RSL3蛋白纳米颗粒的表征

2.4.4 三种蛋白颗粒的DLS表征

2.4.5 其它不同比例复合蛋白的表征

2.5小结

3 蛋白纳米颗粒在细胞水平上的评价

3.1引言

3.2.1主要试剂

3.2.2实验仪器

3.2.3 实验细胞

3.3.1细胞培养

3.3.2细胞毒性实验（MTT试验）

3.3.3 MDA-MB-231细胞对蛋白颗粒的吞噬

3.3.4脂质活性氧检测情况

3.3.5 MDA-MB-231细胞凋亡的检测

3.4实验结果及讨论

3.4.1单纯药物RSL3不同时间段对MDA-MB-231细胞的杀伤毒性

3.4.2流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞对HSA和 Ferritin@HSA两种蛋白纳米颗粒的吞噬效果

3.4.3 激光共聚焦检测MDA-MB-231细胞对HSA和Ferritin@HSA两种蛋白纳米颗粒的吞噬效果

3.4.4 流式细胞仪检测不同纳米材料产生脂质活性氧的情况

3.4.5 激光共聚焦检测脂质活性氧

3.4.6细胞的铁死亡情况的流式细胞仪检测

3.4.7 激光共聚焦表征不同蛋白颗粒处理的 MDA-MB-231 细胞的铁死亡情况

3.4.8 普通荧光显微镜对细胞铁死亡形态的观察

3.5本章小结

4 结论及后续工作建议

参考文献

附录

学位论文数据集

致谢