基于肝星状细胞中内质网和线粒体共同介导的凋亡机制研究青霉呋喃酮A抗肝纤维化作用

摘要

背景：肝纤维化是一类由于肝慢性损伤和细胞外基质合成过量所致的疾病，并伴有较高的发病率，新的靶向治疗方向一直是预防和逆转肝纤维化研究中的重点，鉴于肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化对纤维化的发展具有明显的促进作用，因而一般的抗肝纤维化治疗方案都以诱导活化的HSCs凋亡或抑制HSCs活化为基础来进行。内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ER Stress）作为各类器官纤维化发病机制中的信号串联转导通路，研究其分子机制可为肝纤维化的治疗和预防提供新的药物作用靶点。　　前期研究中显示青霉呋喃酮A（Penicilfuranone A，PFA）具有明显的抗纤维化作用，但其具体作用机制尚未阐明。　　目的：研究PFA是否通过诱导TGF-β1活化的HSCs凋亡来实现其抗纤维化作用，并探讨其分子作用机制，从中寻找药物作用靶点。　　方法：用外源性TGF-β1诱导活化的HSCs作为体外实验的细胞模型，采用细胞毒性实验（MTT）检测PFA对正常肝细胞和两株活化的HSCs的细胞活力影响；采用Hoechst 33258荧光染色、流式Annexin V/PI双染法、DNA Ladder观察PFA处理后细胞的形态学变化和生化改变。采用免疫印迹法、PCR扩增、PAGE凝胶银染法等，检测ERS介导的PERK/eIF2α/ATF4通路、ATF6通路、IRE1α/XBP1通路相关分子的mRNA和蛋白表达水平，以及IRE1α/ASK1通路相关分子的蛋白表达情况；为了探讨 ERS 与线粒体凋亡途径的分子串扰机制，检测Bcl-2家族相关蛋白、胞浆Cyt-C蛋白的表达情况；检测ERS介导的caspase12信号通路相关分子和细胞凋亡标志性分子caspase3、PARP的蛋白表达水平。　　结果：细胞毒性实验显示，PFA的浓度在10 μM-40 μM范围内时，其明显抑制HSCs活力，而对正常肝细胞活力无明显影响。观察细胞形态学变化和生理特征，发现不同浓度 PFA 处理细胞后，活化的 HSCs 发生核凝集、碎裂，磷脂酰丝氨酸外翻，DNA被剪切出现片段化，并伴随caspase3、PARP裂解形式蛋白的表达增加，证实了凋亡现象的出现。检测各细胞信号通路分子 mRNA和蛋白的表达情况，发现PFA处理后并未激活ERS相关的PERK/eIF2α/ATF4、ATF6和IRE1α/XBP1信号通路，而是通过激活IRE1α，启动了下游的ASK1/JNK/p38 MAPK/CHOP 通路。同时 PFA 通过调控 Bcl-2 家族成员来上调胞浆 Cyt-C和caspase12的蛋白表达水平，但未激活calpain 1。caspase12与Cyt-C一起参与激活下游效应分子caspase9，启动caspase级联反应致使HCSs凋亡。　　结论：PFA能诱导TGF-β1活化的HSCs发生凋亡。其作用机制为：PFA调控内质网应激分子IRE1α介导的三条凋亡途径：p38/CHOP、JNK/Bim、caspase12，并与线粒体凋亡途径发生交叉关联，共同激活caspase级联反应导致活化的HSCs发生凋亡。IRE1α可能作为PFA抗肝纤维化的作用靶点。

目录

声明

英文缩略词表

1 引言

1.1 肝纤维化及其研究现状

1.2 肝星状细胞在肝纤维化逆转中的作用

1.3 细胞的凋亡途径

1.4 本文立论依据以及前期基础

1.5 小结

2 青霉呋喃酮A对TGF-β1活化的两株肝星状细胞的凋亡作用

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

3 青霉呋喃酮A诱导TGF-β1活化的肝星状细胞凋亡分子机制研究

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

4 全文总结

致谢

参考文献

个人简历、在校期间发表的学术论文及取得的研究成果