多胺类组蛋白甲基转移酶DOT1L抑制剂筛选及诱导混合谱系白血病细胞凋亡的研究

摘要

混合谱系白血病（Mixed Lineage Leukemia,MLL），因11q23处MLL基因易位重排形成融合蛋白而得名，是一类致死率极高、预后差的高危恶性急性白血病。DOT1L蛋白是目前发现的唯一H3K79甲基化转移酶，也是 MLL白血病的重要靶点，开发DOT1L小分子抑制剂成为治疗MLL白血病的一条新思路。多胺类化合物也因其多靶点性成为抗肿瘤药物的研究热点，目前对于DOT1L抑制剂的设计也主要为多胺类衍生物。本课题首先建立组蛋白甲基转移酶DOT1L抑制剂的虚拟筛选方法，筛选出与DOT1L受体对接评分较高的化合物；设计合成路线合成、分离纯化目标化合物，并进行结构确认；最后考察目标化合物对混合谱系白血病细胞的体外活性研究。研究结果如下：　　（1）根据实验室前期研究基础结合相关文献资料，设计一系列多胺类衍生物，与正处于一期临床实验的阳性化合物EPZ-5676共同构成配体化合物库，从蛋白质晶体数据库PDB中选取受体模型4HRA。用Sybyl-X2.0软件将受体与配体进行分子对接试验，筛选出了分数最高的化合物DUOA003作为目标化合物；　　（2）设计合成路线并完成目标化合物DUOA003的合成工作，通过LC-MS、1HNMR，13CNMR确定目标化合物的结构为：N,N'-(propane-1,3-diyl)bis(2,5-dihydroxybenzamide)；　　（3）以混合谱系白血病细胞MV4-11和巨噬细胞作为研究对象，采用CCK-8法测定两株细胞在目标化合物和阳性药物阿糖胞苷不同浓度（120、100、50、25、10、1、0.1μM）作用24h后的增殖抑制率。结果发现DUOA003和阳性药物阿糖胞苷对MV4-11细胞均有显著的抑制作用，IC50分别为25和28μM，对巨噬细胞的IC50分别为71μM和11μM；选择对正常细胞安全浓度范围考察不同作用时间24h、48h、72h对细胞抑制作用的影响，结果反映出DUOA003对MV4-11细胞的抑制率展现出时间和剂量的依赖性；　　（4）采用Annexin V-FITC/PI法对经高、中、低浓度的药物诱导24h和48h的MV4-11细胞进行染色，在荧光显微镜下观察诱导48h后细胞状态，并用流式细胞仪检测目标化合物诱导MV4-11细胞的凋亡率。结果发现DUOA003能够显著地诱导MV4-11细胞产生凋亡。诱导48h后，与阴性对照组(17.3±5％)相比，DUOA003的低浓度组（53.9±8%）、中浓度组（80.9±9%）、高浓度组（88.5±6%）、以及阿糖胞苷高浓度组（82.6±9%）均呈现显著性差异（P＜0.001），DUOA003诱导的细胞48h后凋亡多处于晚期，阿糖胞苷诱导的细胞凋亡则主要出现在早期；　　（5）用Caspase-3活性测定试剂盒，检测经高、中、低浓度的目标化合物诱导细胞凋亡24h后Caspase-3的活性变化。Caspase-3活性检测显示化合物DUOA003在诱导细胞凋亡24后，与阴性对照组Caspase-3活性测定OD值（0.146±0.002）比较，DUOA003的低浓度组（0.227±0.003）、中浓度组（0.367±0.004）、高浓度组（0.554±0.005）以及阿糖胞苷高浓度组（0.477±0.006）均呈现显著性差异（P＜0.001）。DUOA003诱导混合谱系白血病细胞MV4-11凋亡过程中存在Caspase-3介导的细胞凋亡。

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英文缩写索引

1 绪论

1.1 白血病概述

1.2 白血病发病情况

1.3 白血病治疗方法

1.4 白血病的药物进展

1.5 DOT1L与MLL白血病

1.6 本章小结

2 组蛋白甲基化转移酶DOT1L抑制剂的虚拟筛选

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 分子对接结果与分析

2.4 本章小结

3 目标化合物的合成

3.1 实验仪器及试剂

3.2 实验方法

3.3 多胺衍生物的结构确证

3.4 本章小结

4 DUOA003对混合谱系白血病细胞MV4-11的体外活性研究

4.1 细胞抑制试验

4.2 DUOA003化合物诱导MV4-11细胞凋亡的研究

4.3 DUOA003诱导MV4-11细胞凋亡过程中Caspase-3 活性变化

4.4 本章小结

5 全文总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

致谢

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果