双卤西林酰胺类衍生物的设计、合成及免疫抑制活性的初步研究

摘要

近年来，随着自身性免疫疾病患者以及器官移植手术对免疫抑制剂需求量的增多，急需一种低毒高效且易生产的新型药物出现。免疫抑制剂用于临床治疗免疫性疾病已经多年，可是目前临床上各种免疫抑制剂的毒副作用都比较严重，并且与有效治疗剂量非常地接近。雷帕霉素（Rapamycin）作为当前最有治疗效果的免疫抑制剂，同时也是最早发现的一类mTOR抑制剂。研究发现mTOR信号通路和免疫有着密切的关系，mTOR抑制剂主要通过减少T细胞中细胞因子受体的mRNA合成从而阻断其信号传导，如白介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、CSF、PDGF和IGF,阻断T细胞由G1期至S期，进而发挥免疫抑制作用。但是雷帕霉素的水溶性差、合成成本高、生物利用率低（<15％），因此本研究把目光转向能够克服以上缺点的小分子mTOR抑制剂上。本研究前期利用计算机辅助药物设计手段（CADD），利用虚拟筛选方法以mTOR蛋白为受体得到双卤西林酰胺先导化合物；随后运用逆向分析全合成的方法，合成出具有免疫抑制活性的一系列双卤西林酰胺类衍生物。随后通过体内外生物活性实验证明了药物设计的合理性，并筛选出一种高活性的mTOR免疫抑制剂。最后结合反向对接与药效团模型为下一步获得高效低毒的临床免疫抑制剂提供了科学的理论基础。　　本研究主要内容包括：⑴运用Sybyl2.0X，配体分子从ZINC和PubMed数据库中下载，以mTOR作为受体和近200万个小分子进行虚拟筛选，最终得到先导化合物。⑵采用分子对接方法模拟先导化合物在 mTOR受体中的作用模式，分析化学结构和生物活性的潜在关系，设计新的双卤西林酰胺类衍生物。⑶这个过程使用逆向全合成方法，根据最科学的合成方案得到一系列双卤西林酰胺类衍生物。通过核磁共振氢谱/碳谱（1H-NMR/13C-NMR）以及液质联用（LC-MS）技术，鉴定其结构。⑷体外活性：基于CCK-8技术，测定所合成的化合物对于T淋巴细胞系的急性白血病细胞Jurkat的体外抑制活性，筛选出活性最高的化合物做体内实验；利用Western blotting方法检测经小分子抑制剂处理后细胞蛋白水平的表达。体内活性：用ΔLM-OVA标记的李斯特菌使 C57B1/6小鼠产生特异性免疫应答后，给小鼠通过灌胃方式服用上述化合物。7天之后，取小鼠尾静脉外周血并分离 T淋巴细胞，通过流式细胞术检测 CD8+IFN-γ+T细胞占整个淋巴细胞的比例，以此鉴定化合物的体内生物活性。⑸利用在线免费网络服务器Pharm Mapper让配体化合物与7000多种蛋白受体相互作用，反钓出靶点蛋白以此预测目标分子的毒副作用。⑹收集9种双卤西林酰胺类衍生物的化学结构和体外生物活性数据，以此构建一个药效团模型，并基于药效团模型进行3D-QSAR分析。　　本研究表明：①虚拟筛选确定了3-(2,6-二氯苯基)-5-甲基-N-2-(6-甲磺酰苯并噻唑基)异恶唑-4-甲酰胺为先导化合物。逆向全合成方法以2,6-二氯苯甲醛为原料通过6步反应，得到了9个目标化合物。质谱数据与高效液相色谱数据鉴定发现纯度都达到99%以上，与核磁共振氢谱/碳谱（1H-NMR/13C-NMR）数据均与目标化合物一致。②体外检测药物对细胞增值抑制效应为Cell Counting Kit-8法，运用的细胞为Jurkat T淋巴细胞，将测试OD值转化为可靠有效的活性数据，验证了双卤西林酰胺类衍生物对Jurkat T淋巴细胞的增值抑制作用。经Western blotting方法检测这类化合物的确可以抑制p-mTOR、以及下游蛋白4EBP1、P70S6K。③细胞流式检测结果，发现给药小鼠特异性的 CD8+IFN-γ+T淋巴细胞比空白小鼠明显减少，证明双卤西林酰胺类衍生物确实有体内免疫抑制活性。④经反向对接得到5个打分较高的受体蛋白，因此推测出双卤西林酰胺类衍生物可能与中性白血球减少、神经紊乱、骨骼发育不全以及视力下降有关。⑤药效团模型结果与3D-QSAR结果一致，均表明本研究运用计算机模拟得到先导化合物及衍生物的设计具有合理性与科学性，为设计新型双卤西林酰胺类免疫抑制剂奠定理论基础。

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英文缩写

1 绪论

1.1 研究背景、目的和意义

1.2 研究内容

1.3 主要研究方法和技术路线

2 目标化合物的设计

2.1 先导化合物的设计

2.2 双卤西林酰胺类衍生物的设计

3 化合物的合成

3.1 具体合成路线

3.2 实验部分

4 双卤西林酰胺类衍生物对细胞的增值抑制效应及分子水平检测

4.1 药物的增值抑制效应检测

4.2 药物增值抑制效应分子水平检测

5 小鼠体内免疫效应研究

5.1 实验材料

5.2实验步骤

5.3结果与讨论

6 反向对接与基于药效团的3D-QSAR研究

6.1 基于反向对接的化合物毒副作用预测

6.2 基于药效团叠合的3D-QSAR研究

7 全文总结

参考文献

化合物谱图

个人简历、在校期间发表的学术论文及取得的研究成果