铁蛋白基因FTH1慢病毒载体质粒构建及在肿瘤细胞中的表达

摘要

背景与目的：　　 随着分子影像学在基因治疗中应用范围的不断扩展，磁共振报告基因成像已经成为目前研究的热点。大量的研究已证实了磁共振报告基因成像的可行性及其优势。MR报告基因成像成功克服了磁探针在细胞内会随着细胞的增殖而逐渐降解的缺点，可以在基因治疗过程中对基因的表达及疗效进行动态监视。选择一种有效、稳定、安全的报告基因是磁共振报告基因成像的前提。在众多的磁共振报告基因中，能够通过利用内源性铁实现MR成像的主要有铁蛋白基因和magA基因，前期研究中我们利用magA基因作为磁共振报告基因进行了初步的体外转铁实验，发现magA基因虽然能够转铁，但其转铁量尚不足以引起MR信号的改变。本研究通过已知基因序列克隆FTH1基因，将载有FTH1基因的慢病毒质粒载体转入神经母细胞瘤细胞中，研究FTH1基因在肿瘤细胞中的表达，为进一步实现报告基因成像过程中的基因调控奠定基础。　　 方法:　　 1 FTH1基因片段的PCR扩增及鉴定根据FTH1基因的克隆模板序列(BC000857)，设计合成PCR引物（FTH1-F:5'-GGAATTCATGACGACCGCGTCCACC-3'和口 FTH1-R:5'-TTTGCGGCCGCTTAGCTTTCATTAT-3'），利用PCR扩增技术对FTH1基因的CDS区域进行扩增，获得大量有效的FTH1基因片段，通过酶切鉴定和基因序列测定分析目的基因序列的准确性。　　 2 FTH1慢病毒载体构建用EcoRⅠ、NotⅠ双切酶体系对扩增后的FTH1基因片段和pLenO-GFP慢病毒载体进行双酶切，胶回收技术对酶切后的目的基因和空载病毒载体进行回收，利用DNA连接酶将pLenO-GFP载体DNA和FTH1基因DNA片段连接在一起，经大肠杆菌进行重组质粒的转化，通过PCR及酶切鉴定目的基因与载体连接的准确性。　　 3重组慢病毒的包装制备将包装质粒、包膜质粒和重组后的pLenO-GFP-FTH1依据相关条件共转染293 T细胞，用荧光显微镜观察293 T细胞的荧光表达情况，收集细胞上清液，流式细胞仪(FCM)检测pLenO-GFP-FTH1滴度。　　 4 FTH1基因转染肿瘤细胞及在细胞中的表达将pLenO-GFP-FTH1慢病毒转染神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)，分别于24h和48h在荧光显微镜下观察荧光表达情况，利用流式细胞分选技术，筛选出高表达GFP的细胞株。将FTH1/SK-N-SH细胞株传至4代后，在培养基中加入浓度为500μmol/L的枸橼酸铁进行培养，并将同代未转染病毒的肿瘤细胞作为对照组进行同等条件的培养。利用普鲁士蓝染色及电镜技术分别观察细胞质的变化情况，检测FTH1在肿瘤细胞中的转铁效应。台盼蓝试验检测细胞活性。　　 结果:　　 1 pLenO-GFP-FTH1重组质粒的鉴定酶切鉴定和基因序列测定证实已成功构建pLenO-GFP-FTH1，测得目的基因序列与基因库中的FTH1序列一致。　　 2 FTH1慢病毒包装及滴度测定在病毒包装过程中，用荧光显微镜观察293 T细胞内有大量的绿色荧光显示。用0.1μL GFP-FTH1慢病毒感染293 T细胞后，经流式细胞仪检测荧光表达效率＞85％，病毒滴度约为8.9×108 TU/ml。　　 3 FTH1基因感染神经母细胞瘤细胞慢病毒感染SK-N-SH细胞，荧光显微镜观察靶细胞内有大量绿色荧光显示，且经4次传代后靶细胞内仍可见大量绿色荧光，证实FTH1成功转入神经母细胞瘤细胞中并能在细胞中稳定表达。　　 4 FTH1在靶细胞中的表达普鲁士蓝染色发现试验组肿瘤细胞细胞质内较多蓝染颗粒，经过4次传代后细胞中仍可见蓝染颗粒;对照组细胞内无明显蓝染颗粒。透射电镜观察发现实验组肿瘤细胞中大量有膜包被的致密电子颗粒，对照组呈阴性。台盼蓝显示两组细胞的活细胞率无显著差异。　　 结论:　　 成功构建了铁蛋白基因FTH1慢病毒质粒载体，验证了FTH1基因在神经母细胞瘤细胞中的有效表达，为进一步实现MRI报告基因成像过程中的基因调控奠定了基础。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 pLen0-GFP载体和FTH1基因PCR产物酶切后的鉴定

2．2 重组质粒pLen0-GFP-FTH1的鉴定

2．3 重组质粒测序

2．4 239 T细胞包装病毒荧光

2．5 慢病毒滴度测定

2．6 目的基因转染神经母细胞瘤细胞

2．7 普鲁士蓝染色和透射电镜观察目的基因的表达

3 讨论

4 结论

参考文献

文献综述 磁共振报告基因成像的研究进展

致谢

硕士期间发表论文