uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒的构建及其表达

摘要

利用基因重组技术,用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得uPA eDNA,再克隆到质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建重组质粒pAAV-hrGFP-uPA,通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性.采用磷酸钙共沉淀法,以重组质粒pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒;用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度,再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中,倒置荧光显微镜观察GFP的表达,用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达.结果表明:成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒,病毒滴度达每mL 4×1013病毒颗粒,60%～70%肾小管细胞感染了病毒颗粒,感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白,为今后建立AAV-uPA基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础.