微沟槽图形结构硅橡胶研发及生物相容性初步研究

摘要

目的：　　在课题组前期研究中，采用羟基磷灰石进行表面仿生涂层、β-磷酸三钙和硅橡胶进行共混交联复合，以及以人体碳元素(C)注入等方式改变硅橡胶表面某些性能，以此改善人成纤维细胞在此表面的粘附、增殖能力等。同时也发现，几种改性材料的表面形貌均较普通硅橡胶发生了变化，提示我们硅橡胶的表面形貌影响材料的细胞相容性。为进一步研究材料表面的微形貌对其理化性能以及细胞相容性的影响，本实验通过在表面设计微沟槽图形结构，以此探究表面性能以及细胞增殖、粘附等细胞行为，同时建立大鼠背部软组织缺损动物模型，对改性前后的硅橡胶进行植入应用观察，以期能研制出具有良好软组织填充材料提供理论依据。　　利用具有微沟槽图形的方形母版，采用浇灌的方法成功制作表面具有微沟槽图形的硅橡胶改性材料，同时统一剂量的碳离子注入改性，并选用扫描电镜（ScanningElectron Microscope，SEM）、原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)技术观察改性前后材料表面的微观形貌的变化，X射线光电子能谱（X-ray photoelectronspectroscopy，XPS），水接触角等技术衡量改性前后材料的表面物理化学性能。同时采用了一系列体外实验研究改性前后的材料细胞相容性，以及体内实验分析以及评价改性前后材料的组织相容性，以期能制备出一种符合临床需要，且副作用相对较小的新型软组织填充材料。　　方法：　　本实验分四部分　　第一部分:制备母版和SR、P-SR的制备以及碳离子注入处理表面　　1.两种硅橡胶的制备　　a.具有微沟槽图形结构的硅橡胶制备　　具有微沟槽图形的12cm×12cm方形玻璃母版（中国电子科技集团公司第二十六研究所提供），铁质外框由重庆银利来模具有限公司制作。将室温硫化双组份医用液态硅硅橡胶（成都晨光化工研究院）A、B组分按1∶1混匀后浇灌到母板上，室温下硫化3-4h成膜，取下具有微图形结构的硅橡胶(P-SR)待下一步实验。　　b.光滑的硅橡胶制备　　将同种硅橡胶原材料相同比例混匀后，浇灌到超声镜面的模板上(自制)，待其室温完全硫化后选择平整光滑、无残缺的硅胶片作后续实验。　　2.将SR、P-SR放入多功能离子注入机里进行碳离子注入，剂量为1×1016 ions/cm2，形成C-SR、PC-SR。本步骤由西南核工业物理研究所完成。　　3.实验分组:为普通硅橡胶SR，具有微沟槽图形的硅橡胶P-SR，碳硅橡胶C-SR，碳离子注入后的微沟槽图形硅橡胶PC-SR。　　第二部分:各组硅橡胶微形貌的观察以及理化性能的检测　　样本表面的微观结构布局能够通过SEM、AFM技术手段观测。评价改性前后硅橡胶表面的理化性能则是通过XPS、水接触角分析。　　第三部分:材料的细胞相容性实验　　1.细胞的准备:体外培养法培养人真皮成纤维细胞，将其接种于各组实验样本表面，以待后续实验。　　2.实验分组情况:SR组、P-SR组、P-SR组、PC-SR组。在各组材料表面上接种人真皮成纤维细胞。　　3.各组材料表面细胞的细胞骨架(actin)荧光表达情况由激光共聚焦显微镜可观测材料上细胞的骨架荧光表达情形，间接了解材料表面的细胞形态以及排列情况;并采用CCK-8法检测细胞在各组改性硅橡胶表面1天、2天、4天、6天的增殖情况，采用SSPS17.0进行相关的统计学评价。　　4.应用Western Blot检测分析各组材料上人真皮成纤维细胞粘附相关蛋白Talin、Zyxin、Vinculin的表达情况，并对其进行生物学评价。　　第四部分:材料的组织相容性实验　　1.建立大鼠背部软组织缺损动物模型　　a.购置160-200g雌性成年SD大鼠3只;　　b.将各组改性前后的硅橡胶裁剪成1cm×1cm大小，消毒备用;　　c.3％戊巴比妥钠麻醉SD大鼠，麻醉显效后，常规去毛、消毒铺巾，背部近背脊两侧做6cm×6cm大小术区，做0.5cm纵形切口至皮下，钝性分离出约1.5cm×1.5cm的潜行腔隙，将备用的硅橡胶放置腔隙，切口间断缝合、消毒;　　d.埋置时间7天、15天、1月;　　2.根据埋置时间，适时取材，观察大体形态以及放置液氮灌里存放;　　3.采用HE、Masson、免疫组化等实验技术观察组织-材料反应。　　结果：　　1.成功制备出具有微沟槽图形的P-SR，以及光滑的SR，并采用多功能离子注入机在统一条件下进行碳离子注入，制备出具有微沟槽图形的碳硅橡胶PC-SR，以及碳硅橡胶C-SR。　　2.使用SEM观察改性前后硅橡胶的表面形貌，未发现微观形貌有明显差异。而进一步采用AFM观察，可见普通SR表面光滑;P-SR上可见沟槽整齐的微沟槽图形;进行碳离子注入后的C-SR呈凸凹不平的丘陵地貌，“突出”与“凹陷”形貌各异，并无统一性;而PC-SR见在整齐的微沟槽图形间可见凹凸形貌。　　3.XPS分析显示:注入C后，C-SR、PC-SR与SR、P-SR比较，C、Si、O三种元素的峰值发生改变。水接触角分析得到:微沟槽增加了硅橡胶表面的疏水性;而碳离子注入则增加其表面的亲水性。　　4.通过激光共聚焦显微镜观察各组材料表面人真皮成纤维细胞的骨架情况，间接查看出材料表面形貌学对细胞形态的影响。人真皮成纤维细胞在SR的生长情况较差，细胞稀疏，排列无序;P-SR组细胞生长情况较SR类似，但细胞梭形较SR明显，排列有序。C-SR组细胞生长情况优于SR，且细胞形态铺展，面积增大;PC-SR组，细胞生长优于SR和P-SR,略差于C-SR，细胞铺展情况优于SR和P-SR，但较C-SR差，细胞的排列较C-SR组相比有序。扫描电镜观察各组材料表面人真皮成纤维细胞的细胞形态，观察到材料表面形貌可影响细胞形态以及排列情况。人真皮成纤维细胞在SR排列无序;P-SR组细胞生长情况较SR类似，排列有序。C-SR组细胞铺展面积增大;PC-SR组细胞的排列较C-SR组相比有序。　　5.各种硅橡胶表面对细胞增殖的影响由CCK-8法测定，实验结果显示:C-SR组和PC-SR组分别与SR组和P-SR组相比，细胞增殖明显提高（*P＜0.05），其中C-SR组细胞增殖能力最强，PC-SR稍次之，但两者差异无统计学意义(P＞0.05)。细胞粘附实验结果显示:各组硅橡胶表面对细胞粘附的影响和细胞的增殖趋势基本一致。　　6.Western blot检测各种材料表面细胞粘附相关蛋白(Talin、Zyxin、Vinculin)的表达情况，发现改性后的硅橡胶蛋白表达高于普通硅橡胶，但C-SR与PC-SR之间的蛋白表达情况与细胞增殖情况一致。　　7.成功建立大鼠背部软组织缺损动物模型。　　8.HE染色可见急性期（7天），各组材料炎性细胞浸润明显，各组细胞数量差距不明显;亚急性期（15天）以及慢性期（30天）各组材料周围趋化的炎性细胞数量渐少，且经过碳离子注入后的硅橡胶(C-SR、PC-SR)周围的炎性反应明显低于未注入组(SR、P-SR);表面经过微图案化处理后的硅橡胶周围的炎性细胞数量也较对照组少(P-SR＜SR; PC-SR＜C-SR)，说明微沟槽图形化的碳硅橡胶相比普通硅橡胶，对机体炎性刺激较小。　　9.Masson染色以及α-SMA以及Vimentin免疫组化均可表达材料周围包膜主要成分胶原成分，其结果显示植入后前期，材料周围的纤维化不甚明显，而后期包膜厚度增加，而同一时期比较，经过碳离子处理的硅橡胶(C-SR、PC-SR)周围的包膜厚度以及胶原沉积程度明显低于未注入组(SR、P-SR);表面经过微图案化处理后的硅橡胶周围的胶原沉积程度也较对照组少(P-SR＜SR; PC-SR＜C-SR)，以此可推测经过微沟槽图形化与碳离子注入的硅橡胶包膜厚度较薄，胶原沉积较少，材料与机体组织具有更好的契合度。　　结论：　　1.微沟槽结构的碳硅橡胶制作方法简便，易于操作。　　2.微沟槽结构碳硅橡胶表面理化性能稳定，适度增加表面疏水性。　　3.PC-SR可增加粘附以及增殖能力，且表面微结构促进细胞有序排列，提示材料表面微图形对细胞功能具有显著影响，为设计出具有临床需求的植入材料提供理论依据。　　4.表面微沟槽图形化的碳硅橡胶对机体炎性刺激较轻，包膜厚度较薄，胶原沉着较少，其良好的组织相容性具有较好的应用前景。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 微沟槽图形结构硅橡胶的研发以及表面形貌观察

3．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 微沟槽图形结构硅橡胶的理化性能的检测

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 微沟槽图形结构硅橡胶的细胞相容性研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 微沟槽图形结构硅橡胶的组织相容性研究

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 植入材料表面微形貌的生物学应用及研究进展

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢