LRRFIP1基因干扰预防骨科深静脉血栓形成的实验研究

摘要

研究背景:　　深静脉血栓形成是骨科临床常见并发症之一，好发于下肢骨折患者，如血栓脱落可引起致命性肺栓塞，晚期常遗留静脉炎综合征，严重影响患者的康复及生命安全。新近有研究表明富亮氨酸重复序列相互作用蛋白1(LRRFIP1)可能与血栓的形成有重要联系。LRRFIP1基因及其编码的蛋白质，通过与血小板细胞膜上表达的相关蛋白相互作用，血小板细胞骨架的结构进而发生改变，影响血小板的凝血功能并导致血栓的形成。因此我们拟通过RNA干扰技术靶向沉默LRRFIP1基因，并建立动物模型，观察LRRFIP1基因对深静脉血栓形成的影响，探讨LRRFIP1基因沉默对预防骨科深静脉血栓形成的效果，为最终应用于在体基因治疗深静脉血栓提供相关实验依据。　　研究方法:　　1、LRRFIP1基因RNAi慢病毒载体的构建　　设计并合成LRRFIP1基因靶向的双链DNA:根据GenBank报道的小鼠LRRFIP1基因序列，通过将Ambion公司的设计软件与RNA干扰序列的设计原则相结合，设计出3对针对LRRFIP1基因shRNA的寡核苷酸序列，分别构建质粒，转染293T细胞，RT-PCR和westernblot测定沉默效率，使用沉默效率最高的质粒构建LRRFIP1基因RNAi的慢病毒载体。　　2、小鼠骨髓细胞原代分离与培养　　将1周龄的新生小鼠消毒后处死，分离骨髓细胞，接种于无菌培养瓶，置37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。　　3、小鼠骨髓细胞慢病毒感染　　在24孔培养板接种若干孔，将3～5×104个目的细胞接种至每个孔内，50％左右细胞的贴壁率应在铺板时达到，每孔培养基体积为100μl;70％左右的细胞贴壁率应在进行病毒感染时达到。感染96小时后，在荧光倒置显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。　　4、动物分组与给药　　将健康成年雄性ICR小鼠(20±2g)随机分为:1）正常对照组(control);2)假手术组(sham):不给药;3）低分子肝素(LMWH)治疗组(LMWH):术前通过尾静脉注射LMWH一次(2000U·kg-1)，术后每日注射一次LMWH(2000U·kg-1·d-1);4）模型组(model):术前、术后每日注射等体积生理盐水;5）LRRFIP1shRNA治疗组(shRNA):术前注射LRRFIP1shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs(1×107cells/mouse);6)阴性shRNA治疗组(NegativeshRNA):术前注射LRRFIP1阴性对照shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs(1×107cells/mouse);采用下腔静脉结扎法制作小鼠深静脉模型。　　分别于术后第1、3、7天每组处死6只小鼠。称量血栓重量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清p选择素及D二聚体水平，Westernblot检测血栓中LRRFIP1蛋白的表达。　　5、统计分析　　计量资料表示为means±S.D。采用SPSS17.0forWindows进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用FisherLSD分析。以p＜0.05作为有统计学差异。　　结果:　　1.成功构建了携LRRFIP1shRNA的慢病毒载体，LRRFIP1shRNA转染后LRRFIP1基因及蛋白表达均显著降低;　　2.LRRFIP1shRNA显著抑制血栓中LRRFIP1蛋白表达。在模型组中，在术后第1、3、7天血栓中LRRFIP1蛋白的表达显著降低(P＜0.01)。在所观察的3个时间点上，使用LRRFIP1shRNA处理可以进一步抑制LRRFIP1在血栓中的表达，提示LRRFIP1shRNA慢病毒在体内可以有效抑制LRRFIP1的表达。但低分子肝素和阴性shRNA对LRRFIP1表达无影响。　　3.LRRFIP1shRNA显著抑制小鼠下肢静脉血栓形成。LRRFIP1shRNA抑制体内血栓形成明显的。在术后第7天，模型组小鼠血栓重量为8.63±0.40mg，在LRRFIP1shRNA治疗组，血栓重量降低到2.15±0.57mg(P＜0.01)。血栓形成抑制率为75.10％。而在低分子肝素治疗组和阴性shRNA治疗组，血栓重量分别为2.20±0.33mg和6.47±0.66mg，血栓形成抑制率分别为74.50％and25.02％。　　4.LRRFIP1shRNA能够降低小鼠血清p-选择素和d-二聚体水平。与正常对照组和假手术组相比，模型组血浆P-选择素水平明显增加(P＜0.01)。LRRFIP1shRNA治疗显着降低血浆P-选择素水平(P＜0.01)。血浆D-二聚体水平在模型组也明显升高(P＜0.01)，而LRRFIP1shRNA治疗可显著地抑制D-二聚体水平的上调(P＜0.01)。然而，低分子肝素和阴性shRNA对血浆P-选择素、D-二聚体水平的影响不大。　　结论:　　1.成功构建了LRRFIP1shRNA表达质粒及慢病毒载体;　　2.LRRFIP1shRNA在体内、外均能够抑制LRRFIP1mRNA和蛋白表达;　　3.LRRFIP1基因干扰能抑制小鼠下肢深静脉血栓形成;　　4.LRRFIP1shRNA抑制深静脉血栓形成与其降低血浆p-选择素和d-二聚体水平有关。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 LRRFIP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及转染效率的鉴定

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 小结

2．5 讨论

第三章 小鼠骨髓细胞慢病毒感染及深静脉血栓动物模型的建立

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．3 试验结果

3．4 小结

3．5 讨论

第四章 LRRFIP1基因干扰对小鼠深静脉血栓形成的作用

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 小结

4．5 讨论

全文总结

参考文献

文献综述一 深静脉血栓相关的分子标志物研究进展

文献综述二 骨科大手术静脉血栓栓塞症的相关危险因素及防治措施

学习期间发表的论文

致谢