阻断腺苷A2a受体对大鼠大脑中动脉缺血/再灌注损伤中纹状体区GLT-1影响的研究

摘要

背景：缺血性卒中是脑的供血动脉短暂或永久性闭塞，导致其供血区血流量急剧下降而出现相应神经功能缺失的一类严重疾病，发病率高达250-400/10万，死亡率约30％，幸存者多遗留有永久性残疾，严重威胁着人类的健康。但遗憾的是，对缺血性卒中尚无有效的脑保护治疗措施。理论上钙离子拮抗剂等药物对缺血性脑损害有保护作用，但在临床应用中却效果欠佳。因此探索新的脑保护途径非常必要。　　 腺苷(adenosine, ADO)是生物体代谢过程的中间产物，也是一种重要的信号分子。它通过与神经细胞上的不同受体结合，调节一系列重要生理过程。生理状态下腺苷受体被适度的腺苷激活，在睡眠与觉醒、认知和记忆、运动、情绪等方面发挥重要作用。目前已发现的腺苷受体包括A1R，A2aR，A2bR和A3R 四种亚型。这四种受体同属G蛋白偶联受体家族。其中A1R，A2aR为高表达受体，较低浓度的ADO 就可将其激活产生生物学效应。但诸如在缺血、缺氧、外伤、神经元过度放电等代谢紊乱的情况下。大量释放的ADO 会通过激活腺苷受体加重兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAAs）所造成的脑损伤。研究还发现，A1R 被激活后Glu的释放减少，而A2aR 被激活后Glu的释放增加。因此，Glu的释放及其功能在一定程度上受腺苷及其受体的调节。研究发现阻断A2aR对脑缺血具有神经保护作用，可使脑梗死的体积缩小，神经功能得到改善。推测并初步证明了阻断A2aR对神经元缺血性损伤的保护作用可能与抑制Glu 释放有关。本课题组前期的研究发现，阻断腺苷A2aR后，脑缺血区细胞外谷氨酸含量明显低于对照组，但尚未阐明导致细胞外谷氨酸堆积减少的机制及可能产生的环节。　　 在中枢神经系统中，谷氨酸转运体1（GLT-1）广泛分布于神经胶质细胞，承担了90％的谷氨酸转运任务。有研究发现，A2aR 激活后可以抑制胶质细胞上GLT-1转运谷氨酸的功能。因此我们推测，阻断A2aR 产生的缺血性神经保护作用，可能与增强了GLT-1的功能并进而加速了谷氨酸转运，降低细胞外谷氨酸堆积有关。　　 目的：以大鼠大脑中动脉栓塞模型（Middle cerebrAlartery occlusion, MCAO）为研究对象，观察A2aR 拮抗剂阻断腺苷A2aR对大鼠大脑中动脉缺血/再灌注后脑梗死体积、神经功能评分及纹状体区GLT-1表达的影响。以揭示阻断A2aR 产生的神经保护机制，为进一步临床研究选择给药的时机和作用靶点奠定基础。　　 方法：根据longa 提出的可逆性MCAO 线栓法加以改进制作局灶性脑缺血及再灌注模型。分别在雄性SD大鼠脑缺血2h、缺血2h/再灌注22h两个时相点给予腺苷受体A2a 拮抗剂SCH-58261(选择性腺苷受体A2a 拮抗剂)，之后观察大鼠神经功能缺损情况和脑梗死体积。并采用RT-PCR、WB 方法检测纹状体区GLT-1的表达情况。　　 结果：（1）神经功能缺损评分：缺血2h对照组评分2.33±0.52，缺血2h 干预组2.67±0.52，两者无明显差异；缺血2h/再灌注22h对照组评分2.50±0.55，缺血2h/再灌注22h 干预组1.67±0.52，二者有显著差异（P<0.05）；缺血2h/再灌注22h 干预组评分明显低于缺血2h 干预组。　　 （2）脑梗死体积测算：缺血2h/再灌注22h的梗死体积明显大于缺血2h的梗死体积；干预组的梗死体积均小于缺血对照组。缺血2h 干预组的梗死体积（23.63±3.89 mm3）比对照组（28.26±2.48 mm3）缩小了16％，有显著差异（P<0.05）。缺血2h/再灌注22h干预组的梗死体积（95.12±18.22 mm3）比对照组（141.80±27.64 mm3）缩小了33％，二者有显著差异（P<0.01）。　　 （3）GLT-1的免疫荧光观察：应用免疫荧光FITC 标记法，结合激光共聚焦显微镜显示大鼠纹状体区GLT-1的大体分布。通过观察发现，GLT-1阳性信号多位于神经细胞的胞膜上。　　 （4）GLT-1的Western Blot 观察：与缺血对照组和正常对照组比较，干预组大鼠纹状体中GLT-1蛋白含量均明显增加（p<0.01）。与正常对照相比，缺血2h对照组GLT-1的蛋白含量明显降低（p<0.05），而缺血2h/再灌注22h对照组GLT-1反而有所升高（p<0.05）。　　 （5）GLT-1mRNA RT-PCR 观察：与缺血对照组和正常对照组比较，SCH-58261明显增加了缺血大鼠纹状体中GLT-1mRNA的表达（p<0.01）。与正常对照组相比，缺血对照组GLT-1的表达均有所降低（p<0.05），其中以缺血2h 尤为明显。　　 结论：研究结果提示，脑缺血可诱导大鼠脑神经元损伤;腺苷受体A2a 拮抗剂SCH-58261可减轻大鼠脑缺血/再灌注时的脑梗死体积，及改善缺血大鼠的神经功能;同时腺苷受体A2a 拮抗剂SCH-58261可改善脑缺血/再灌注导致的GLT-1表达下降;提示脑缺血/再灌注过程中腺苷受体A2a 参与的神经元损伤机制可能与其参与GTL-1表达有关。

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结 果

讨 论

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全文小结

参考文献

致 谢

文献综述 谷氨酸与缺血性脑损伤

硕士研究生期间发表的文章