铜绿假单胞菌噬菌体PaP1与宿主相互作用的研究：噬菌体感染和噬菌体耐受的机制

摘要

噬菌体是自然界中最广泛存在的生物,其数量约为细菌的10倍。因此,细菌和噬菌体在自然界中一直存在着斗争和共存。一方面,细菌有一系列的免疫机制来抵抗噬菌体感染,如抑制噬菌体吸附、阻止噬菌体DNA进入、剪切噬菌体DNA、流产感染等机制。而另一方面,噬菌体也可以进化出相应的机制来对抗细菌的免疫。噬菌体感染的第一步就是吸附到宿主表面,多种噬菌体受体已经被鉴定出来,如脂多糖(LPS),加膜多糖(CPS),鞭毛和膜蛋白等等。作为细菌的防守手段,细菌可以通过改变这些受体的结构来阻止噬菌体的吸附,如细菌可以修饰这些受体的结构、分泌胞外基质来覆盖这些受体,或者分泌抑制性分子抑制噬菌体的结合。而同时,噬菌体又可通过改变其受体结合蛋白,如尾丝蛋白的结构,来感染原来耐受的细菌,从而最终杀死细菌。例如,荧光假单胞菌SBW25及其裂解性噬菌体phi2可以共存300多代,并不断的发生共同进化,这主要就是通过改变受体结构和噬菌体尾丝蛋白的结构导致的。　　铜绿假单胞菌是临床上常见的革兰阴性条件致病菌,是医院内感染的主要病原菌之一,常见于烧伤、重症监护病房、免疫力低下的病人,以及囊性纤维化的病人。而且,由于铜绿假单胞菌能耐受多种抗生素,因此经常导致治疗失败和病人死亡的。噬菌体作为一种可以杀死细菌的病毒,在发现初期就被应用于临床感染的治疗,但随着抗生素的发现和普及,噬菌体治疗被逐渐忽视。但是随着细菌耐药性问题的日益严重,人们已经面临无药可用的危险处境了。因此,噬菌体治疗的临床应用前景在近年来又受到了重视。越来越多的研究已经开始探索噬菌体治疗的效果。但是,要将噬菌体治疗最终用于临床,噬菌体-宿主的相互作用机制必须先期的深入研究,才能为今后的临床研究打下坚实的基础,并为设计出更好的噬菌体治疗策略提供理论指导。　　我们实验室最近分离鉴定了四株铜绿假单胞菌噬菌体。本课题以其中一个裂解性噬菌体PaP1及其宿主铜绿假单胞菌PA1为模型,分别研究了噬菌体PaP1感染细菌的机制,以及细菌PA1耐受噬菌体的分子机制:　　1.鉴定了噬菌体PaP1的受体结合蛋白是尾丝蛋白(tail fiber)。噬菌体感染的第一步就是通过受体结合蛋白(RBP)吸附在宿主表面。但是铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白介导的宿主特异性研究还不清楚。本研究的目的就是鉴定铜绿假单胞菌噬菌体的受体结合蛋白,并对其进行遗传改造。我们发现铜绿假单胞菌噬菌体PaP1和JG004的基因组序列非常相似,但是两个噬菌体的宿主却完全不一样。我们通过遗传学手段,发现噬菌体JG004的尾丝蛋白的一个点突变使得其可以同时感染PA1和PAO1。而将PaP1的尾丝蛋白替换为JG004的尾丝蛋白后,重组的PaP1噬菌体则完全改变了其宿主特异性。因此,此研究鉴定了铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白是吸附宿主的RBP,而且我们可以对其进行遗传改造,这为噬菌体治疗的研究打下了一定的基础。　　2.发现了一种新的噬菌体耐受机制:―断臂求生‖。自然环境中细菌时时刻刻都面临着噬菌体的感染,因此细菌有多种耐受噬菌体的机制,如抵抗噬菌体吸附、抑制噬菌体 DNA进入、限制-修饰系统、CRISPR-Cas系统、流产感染等等。本研究以铜绿假单胞菌及其裂解性噬菌体PaP为模型,分离鉴定了耐受噬菌体的突变菌株PA1r,意外的是耐受噬菌体的铜绿假单胞菌 PA1r可以分泌红色色素。于是我们对敏感株 PA1和PA1r进行了全基因组测序,并进行了比较基因组学分析。发现PA1r基因组中丢失了一段219.6KB的片段。其中hmgA基因的丢失,导致了一种红色底物尿黑酸的积累,而galU基因的丢失则导致PA1r失去了脂多糖(LPS)。而LPS是噬菌体PaP1的受体,因此噬菌体无法吸附上PA1r。动物实验证实,PA1r丢失脂多糖之后,毒力显著下降,这也是噬菌体治疗的一种优势。因此,本研究发现了一种通过剪切自身基因组而耐受噬菌体的新机制。

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第一章 前言

第二章 铜绿假单胞菌噬菌体PaP1感染宿主的机制

2.1 铜绿假单胞菌噬菌体的宿主特异性

2.1.1 试剂与材料

2.1.2 实验方法

2.1.3 结果与讨论

2.2一株宿主谱扩展的突变噬菌体的分离鉴定

2.2.1 试剂与材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 结果与讨论

2.3噬菌体PaP1尾丝蛋白的遗传改造

2.3.1 试剂与材料

2.3.2 实验方法

2.3.3 结果与讨论

第三章 铜绿假单胞菌野生株PA1及耐受株PA1r的全基因组测序分析

3.1 噬菌体PaP1耐受菌株PA1r的分离鉴定

3.1.1 试剂与材料

3.1.2 实验方法

3.1.3 结果与讨论

第四章 细菌耐受噬菌体的新机制—“断臂求生”

4.1 噬菌体耐受菌株PA1r基因组片段丢失的验证

4.1.1试剂与材料

4.1.2 实验方法

4.1.3 结果与讨论

4.2 噬菌体耐受菌PA1r分泌红色色素的机制

4.2.1 试剂与材料

4.2.2 实验方法

4.2.3 结果与讨论

4.3宿主菌耐受噬菌体PaP1相关基因基因的寻找

4.3.1 试剂与材料

4.3.2 实验方法

4.3.3 结果与讨论

4.4噬菌体耐受菌PA1r耐受的机制研究

4.4.1 试剂与材料

4.4.2 实验方法

4.4.3 结果与讨论

4.4噬菌体耐受菌丢失片段是非位点特异性的

4.4.1试剂与材料

4.4.2 实验方法

4.4.3结果与讨论

4.5噬菌体耐受菌PA1r的毒力显著下降

4.5.1试剂与材料

4.5.2 实验方法

4.5.3结果与讨论

4.6基因组片段的丢失是发生在噬菌体感染之前

4.6.1试剂与材料

4.6.2 实验方法

4.6.3结果与讨论

全文总结

参考文献

文献综述

攻读博士学位期间的科研成果

致谢