铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的基因组学研究:一种由EndonucleaseV介导的细菌免疫新机制的发现与证实*

摘要

铜绿假单胞菌是临床上常见的革兰阴性条件致病菌,能耐受多种抗生素,是医院内感染的主要病原菌之一。噬菌体是一类专门侵染细菌的病毒,在自然界中广泛存在,数目约为细菌的10倍。噬菌体易于培养、基因组小且结构简单,一直是研究多种基本生命现象的重要对象与材料。对噬菌体进行鉴定和分类是噬菌体研究中的一项基本工作。目前大部分新鉴定的噬菌体已经归类为不同的属,但还有相当一部分噬菌体没有明确的分类。
　　对噬菌体进行全基因组测序和注释是做噬菌体研究的重要内容。最初的基因组测序主要使用全基因组“鸟枪”测序法。然而某些噬菌体基因组的“鸟枪”测序并不顺利,有时甚至不得不半途而废。早在2004年,本实验室就遇到了一个难以测序的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的基因组。当时张克彬博士和黄建军博士前后分两次委托不同的商业化测序公司采用当时流行的“鸟枪”测序法对该噬菌体进行全基因组测序,然而始终得不到PaP1基因组的完整序列。因此噬菌体PaP1基因组的测序工作不得不搁置。
　　直到在2008年第二代测序技术的推广应用后,我们才委托测序公司通过罗氏454测序技术顺利地获得了噬菌体PaP1的全基因组序列(91,715bp)。本文将进行噬菌体PaP1基因组的详细注释与比较基因组学分析,并深入探讨该基因组“鸟枪法”难以测序的原因。研究内容和结果主要包括以下几个方面:
　　1.铜绿假单胞菌PA1及其噬菌体PaP1一般生物学特性的补充研究。确定了铜绿假单胞菌PA1的生长特点、革兰阴性形态及其胞外基质与鞭毛的形态。使用PEG8000浓缩沉淀的方法制备PaP1的粗制颗粒,再进行离心超滤得到纯化的PaP1颗粒。使用透射电镜观察PaP1颗粒的形态,分析出其具有二十面体对称的头部(直径约为69nm)和收缩性的尾部(长度约为139nm),这是确定其为肌尾噬菌体的重要依据。
　　2.噬菌体PaP1基因组末端的鉴定。使用罗氏454测序方法测出PaP1基因组全长为91,715bp。通过限制性酶切的方法确定PaP1基因组为线性dsDNA分子,并确定了其末端的位置。分别回收PaP1基因组DNA5’末端和3’末端的酶切片段,使用我们所设计的末端鉴定引物进行末端测序。我们设计了一种新的噬菌体末端鉴定策略,使用该策略鉴定出PaP1基因组DNA具有1190bp长的末端冗余。
　　3.噬菌体PaP1基因组的生物信息学及比较基因组学分析。通过GC含量的分析确定PaP1基因组的复制起始位点位于该基因组末端。通过开放阅读框(ORF)和编码序列(CDS)的鉴定确定了PaP1基因组有169个推定的基因(其中包含12个tRNA基因)。使用BlastP分析了PaP1基因的推定功能,并将PaP1基因组的注释信息提交给GenBank(登录号:NC_019913)。对铜绿假单胞菌的四株肌尾噬菌体(PaP1、JG004、PAK_P1和vB_PaeM_C2-10_Ab1)进行了比较基因组学分析,构建了其主要衣壳蛋白的进化树,并建立了噬菌体的一个新属:PaP1样噬菌体属。
　　4.噬菌体PaP1结构蛋白的SDS-PAGE及质谱鉴定。采用浓缩后的PaP1粗制颗粒进行SDS-PAGE实验,将PaP1的结构蛋白显示在聚丙烯酰胺凝胶上。分别切离不同的PaP1蛋白条带,并进行蛋白的胶内酶解,然后进行HPLC-MS。最后一共鉴定出12个PaP1结构蛋白的编码基因,即通过实验证实了这12个PaP1基因的功能是编码结构蛋白。
　　5.噬菌体PaP1基因组“鸟枪法”测序难题的研究。把之前PaP1基因组“鸟枪法”测序所获得的43个重叠群(contigs)定位在PaP1全基因组上,发现有约一半的序列是“鸟枪法”所测不出来的。我们阅读文献发现“鸟枪法”测序的宿主菌(大肠杆菌DH5α)可以编码识别修饰碱基的酶EndonucleaseⅤ(EndoⅤ)。而PaP1基因组DNA可以被EndoⅤ所切割,同样条件下“鸟枪法”测序成功的PaP3基因组DNA不可以被EndoⅤ所切割。这为PaP1基因组“鸟枪法”测序难题的解开提供了线索。
　　6.EndoⅤ介导的细菌免疫机制的研究。我们通过λ-Red重组的方法敲除了大肠杆菌DH5α编码EndoⅤ的基因nfi,构建了突变株DH5αΔnfi。然后使用DH5αΔnfi作为“鸟枪法”克隆建库的宿主菌,重新对PaP1基因组进行“鸟枪法”测序,结果顺利完成了其测序。我们通过单分子实时(SMRT)测序的方法鉴定出PaP1基因组DNA中分布有7557个修饰碱基(包括152个m4C和51个m6A)。据此我们提出细菌通过EndoⅤ排斥噬菌体含有修饰碱基核酸的这样一种新的细菌免疫机制。
　　综上所述,本文对PaP1长91,715bp的基因组进行了详细的注释,通过比较基因组学的分析建立了铜绿假单胞菌肌尾噬菌体中的一个新的属:PaP1样噬菌体属,解析了PaP1的12个结构蛋白编码基因,探讨了“鸟枪”测序法无法测序的PaP1基因组采用二代测序技术就可以测出全序列的根本原因并提供了解决办法,还揭示了细菌通过EndoⅤ免疫排斥外来侵染核酸、保持物种遗传稳定的免疫新机制。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 铜绿假单胞菌PA1及其噬菌体PaP1一般生物学特性的补充研究

2.1 铜绿假单胞菌PA1的一般生物学特性

2.2 噬菌体PaP1的一般生物学特性

第三章 噬菌体PaP1基因组的测序与末端的鉴定

3.1 噬菌体PaP1的基因组测序

3.2 噬菌体PaP1基因组末端位置的推定

3.3 噬菌体PaP1基因组末端冗余的鉴定

第四章 噬菌体PaP1的基因组学研究：建立PaP1样噬菌体新属

4.1 噬菌体PaP1基因组一般特征的分析

4.2 噬菌体PaP1基因组的注释

4.3 基于序列的分类学研究：建立PaP1样噬菌体新属

第五章 噬菌体PaP1结构蛋白的SDS-PAGE及质谱鉴定

5.1 噬菌体PaP1结构蛋白的SDS-PAGE

5.2 噬菌体PaP1结构蛋白的质谱鉴定

第六章 噬菌体PaP1难测序之解：发现EndoⅤ介导的细菌免疫新机制

6.1 噬菌体PaP1基因组“鸟枪法”测序失败及其原因推断

6.2 噬菌体PaP1基因组DNA的EndoⅤ酶切实验

6.3 大肠杆菌DH5αEndoⅤ编码基因（nfi）的敲除

6.4 使用DH5αΔnfi作为宿主菌重新对PaP1进行“鸟枪法”测序

6.5 噬菌体PaP1基因组DNA中稀有碱基的鉴定

参考文献

文献综述细菌免疫机制的研究进展

参考文献

攻读博士学位期间的科研成果

致谢