重编程因子对小鼠组蛋白H3K4/27甲基化酶基因启动子活性的影响

摘要

表观遗传修饰主要是研究在DNA序列不发生改变的前提下可遗传基因的表达发生的改变，组蛋白修饰已成为表观遗传领域的研究热点。其中组蛋白修饰酶在组蛋白修饰过程中起着至关重要的作用，而重编程因子可以诱导体细胞重编程成为iPS细胞，这一过程又是由一系列的表观遗传修饰酶调控的，因此这些重编程因子可能对表观遗传修饰酶具有一定的影响，重编程因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和组蛋白甲基化在这一过程中起着十分重要的作用，但它们之间具体存在何种联系至今仍不清楚。因此在本研究中，我们通过启动子分析的方法来研究这些重编程因子对组蛋白三甲基化酶EZH1和EZH2表达调控的影响。首先我们进行了预实验，克隆了小鼠H3K4三甲基化酶Smyd3和Mll1的基因启动子，构建了五条Smyd3启动子5'缺失片段-pGL3和四条Mll1启动子5'缺失片段-pGL3重组质粒，分别是Smyd3-1、2、3、4、5和Mll1-1、2、3、4。然后构建重编程因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog-pcDNA3.1重组质粒。Smyd3的五个重组质粒单独转染到HEK293细胞，而Mll1的四个重组质粒和重编程因子的重组质粒共转染到HEK293细胞，通过双荧光素酶报告基因检测系统检测Smyd3和Mll1缺失突变体重组质粒荧光素酶报告基因的性对活性。预实验结束后，本研究通过PCR的方法分别克隆了4条小鼠组蛋白三甲基化酶EZH1和EZH2启动子5'缺失片段，与pMD19-T载体连接，双酶切克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体，构建EZH1-1、2、3、4和EZH2-1、2、3、4-pGL3报告基因重组质粒，与重编程因子共同瞬时转染HEK293细胞48h后通过荧光素酶报告基因检测系统检测EZH1和EZH2启动子各缺失片段的相对荧光活性。之后对小鼠体内受精体内培养的1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-16-细胞、桑椹胚和囊胚6个胚胎时期进行EZH1和EZH2的荧光定量PCR检测在各期内它们的表达情况。结果表明:成功构建Smyd3、Mll1、EZH1、EZH2启动子5'端缺失片段-pGL3荧光报告基因重组质粒，其中Smyd3所构建的启动子重组子转染组与阳性对照组相比表现出荧光活性，并且Smyd3-4-pGL3的荧光活性最强，是其它的2至4倍左右， Smyd3-5-pGL3的荧光活性最弱。本研究认为Smyd3基因的启动子核心区域可能位于-533～-42 bp之间，在-2026～-533 bp之间可能存在启动子负调控序列。而引人重编程因子的转染组中，Sox2、Oct4对Mll1启动子活性具有抑制作用，Nanog对其活性具有一定的促进作用，而c-Myc和Klf4对其活性几乎没有什么作用;Sox2、Klf4、Nanog和c-Myc对EZH1启动子活性具有促进作用，而Oct4对其活性几乎没有作用;Sox2和Oct4对EZH2启动子活性具有一定的抑制作用吗，而Klf4、c-Myc和Nanog对其活性具有一定的促进作用。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 前沿

1．2 组蛋白H3K4和H3K27甲基化酶

1．3 转录因子对细胞重编程的影响

1．4 启动子方法研究重编程因子对组蛋白甲基化酶的影响

1．5 展望

2 引言

3 重编程因子对小鼠组蛋白H3K4／27甲基化酶基因启动子活性的影响

3．1 实验材料

3．1．1 实验细胞和动物

3．1．2 实验药品和耗材

3．1．3 实验仪器设备

3．1．4 实验试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 体内各期植入前胚胎的获取

3．2．2 植入前胚胎6个时期定量PCR模板的获取

3．2．3 基因组DNA的提取

3．2．4 Smyd3、Mll1、EZH1和EZH2的基因启动子引物以及EZH1和EZH2的定量引物的设计

3．2．5 小鼠Smyd3、Mll1、EZH1和EZH2的基因启动子缺失突变体扩增

3．2．6 小鼠EZH1和EZH2实时荧光定量PCR的扩增

3．2．7 启动子扩增片段胶回收

3．2．8 扩增的启动子缺失突变体与pMD19-T重组质粒的制备

3．2．9 真核启动子报告基因重组质粒的构建

3．2．10 重编程转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog、Klf4基因的引物设计

3．2．11 重编程转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog、Klf4基因扩增

3．2．12 重编程转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog、Klf4与pGEM-T重组质粒的制备

3．2．13 转染真核细胞的转录因子扩增片段-pcDNA3.1重组质粒的制备

3．2．14 HEK293细胞培养、转染和荧光素酶检测

3．3 实验结果

3．3．1 小鼠Smyd3、Mll1、EZH1和EZH2的基因启动子引物以及EZH1和EZH2的定量引物的设计

3．3．2 小鼠Smyd3、Mll1、EZH1和EZH2基因启动子缺失片段扩增结果

3．3．3 小鼠Smyd3、Mll1、EZH1和EZH2基因启动子缺失片段-pMD19以及Smyd3、Mll1、EZH1和EZH2基因启动子缺失片段-pGL3PCR鉴定及重组质粒的提取和双酶切

3．3．4 小鼠Sox2、Nanog、Oct4、Klf4、c-Myc转录因子扩增结果

3．3．6 小鼠Smyd3、Mll1、EZH1和EZH2基因启动子缺失片段-pGL3荧光素酶报告基因检测

3．3．7 小鼠EZH1和EZH2荧光定量PCR扩增

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介

在读硕士研究生期间发表论文目录