声明
主要符号对照表
第一章 引言
1.1 禽流感病毒概述
1.2 AIV蛋白结构与功能
1.2.1 血凝素（HA）
1.2.2 神经氨酸酶（NA）
1.2.3 聚合酶蛋白（PB1、PB2、PA）
1.2.4 核蛋白（NP）
1.2.5 非结构蛋白（NS）
1.2.6 基质蛋白（M）
1.3 H5亚型AIV流行情况
1.4 AIV诊断方法
1.4.1 血清学诊断
1.4.2 分子生物学诊断方法
1.4.3 杂交瘤抗体基因测序与体外重组表达研究进展
1.5 研究目的和意义
第二章 H5N6亚型高致病性禽流感病毒TaqMan双荧光RT-PCR方法的建立
2.1 实验材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验动物
2.1.3 主要实验试剂与仪器
2.1.4 病毒RNA的提取
2.1.5 引物及探针
2.1.6 TaqMan荧光RT-PCR反应体系
2.1.7 TaqMan荧光RT-PCR特异性试验
2.1.8 TaqMan荧光RT-PCR敏感性试验
2.1.9 对临床样品的检测
2.2 实验结果
2.2.1 引物组筛选
2.2.2 特异性试验
2.2.3 敏感性试验
2.2.4 对临床样品的检测
2.3 讨论
第三章H5亚型禽流感病毒数字PCR方法的建立
3.1 实验材料
3.1.1 实验毒株
3.1.2 试剂与器材
3.1.3 病毒RNA的提取
3.1.4 引物及探针设计
3.2 实验条件
3.2.1 TaqMan real time RT-PCR反应体系与条件
3.2.2 数字PCR（dPCR）反应条件优化
3.2.3 特异性试验
3.2.4 敏感性试验
3.2.5 重复性试验
3.2.6 现地样品的检测
3.3 实验结果
3.3.1 dPCR反应条件的确定
3.3.2 dPCR特异性试验结果
3.3.3 敏感性试验结果
3.3.4 标准曲线的绘制
3.3.5 重复性试验结果
3.3.6 现地样品检测结果
3.4 讨论
第四章 H5N1亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的制备与体外重组表达
4.1 实验材料与实验动物
4.2 实验试剂与仪器
4.3 实验方法
4.3.1 蔗糖梯度纯化病毒总蛋白
4.3.2 BCA蛋白定量分析试剂盒测定总蛋白的浓度
4.3.3 免疫动物
4.3.4 免疫效价的测定
4.3.5 骨髓瘤细胞（SP20）的制备
4.3.6 饲养层细胞的制备
4.3.7 细胞融合
4.3.8 融合细胞半换液
4.3.9 融合检测（间接ELISA与HI）
4.3.10 杂交瘤细胞亚克隆
4.3.11 杂交瘤细胞的冻存与亚型鉴定
4.3.12 腹水的制备
4.3.13 腹水的纯化
4.3.14 竞争ELISA方法的建立
4.3.15 抗体的标记（辣根过氧化酶标记法）
4.3.16 细胞总RNA提取
4.3.17 总RNA反转录
4.3.18 PCR反应
4.3.19 胶回收、连接、转化、挑菌、菌液PCR、提质粒、测序
4.3.20 cDNA 5'末端的快速扩增（5'Race）
4.3.21 cDNA 3'末端的快速扩增（3'Race）
4.3.22 重链与轻链全长扩增体系
4.3.23 连接、转化、摇菌、菌液PCR、测序
4.3.24 转化阳性质粒
4.3.25 提取质粒
4.3.26 转染CHO细胞
4.3.27 间接免疫荧光实验
4.3.28 Western Blot
4.3.29 细胞上清浓缩
4.4 实验结果
4.4.1 纯化蛋白浓度测定
4.4.2 免疫效价的测定
4.4.3 筛选出杂交瘤细胞与抗体亚类的鉴定
4.4.4 竞争ELISA方法的建立
4.4.5 标记后竞争ELISA方法的建立
4.4.6 重链与轻链的PCR结果
4.4.7 20B3、21D2、22G3重链与轻链5'Race与3'Race测序结果
4.4.8 20B3、21D2、22G3重链与轻链全长测序结果
4.4.9 抗体可变区分区结果
4.4.10 重组表达抗体间接免疫荧光（IFA）结果
4.4.11 体外重组抗体血凝抑制（HI）结果
4.4.12 体外重组抗体Western Blot结果
4.5 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
中国农业科学院;
