基于胶体金和等温信号扩增的CYP2D6基因分型方法的研究

摘要

人体的基因组或基因变异会对药物在人体内吸收代谢、使用疗效以及是否产生不良反应都会产生影响，而药物基因组学(Pharmacogenomics)则是研究这种影响产生的机制以及表现方式，进而指导新药开发和合理用药的一门新学科。
　　基因多态性是导致个体对药物反应差异性的主要原因。据联合国世界卫生组织统计，全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用药所致。细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 enzymes，CYP)催化的药物生物转化是药物代谢中最重要的一个系统，对外源性药物和毒物的代谢有非常重要的意义。CYP是一组β族细胞色素超家族蛋白酶，它以血红蛋白为辅基，可参与多种物质，包括生理性物质、毒性物质、致癌物质以及约90％的临床常用药在体内的代谢和转化。细胞色素酶CYP2D6是CYP中一种重要药物代谢酶，也是迄今为止发现最具有遗传多态性特征的代谢酶，其代谢的药物约占CYP代谢总药物的20％。CYP2D6基因多态性使药物代谢在不同种族之间，不同人群中产生较大的差异，从而影响药物的疗效。快速分析CYP2D6基因的多态性，对指导临床合理用药和调整用药方案具有重大意义。
　　基因多态性分析的传统方法主要是基于聚合酶链式反应(PCR)技术的分子诊断技术，如限制性片段长度多态性分析（Restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP）、等位基因特异性扩增法(Allele-specific amplification，ASA)、实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)、测序技术(DNA sequencing)，它们的灵敏度可以达到几个拷贝。然而这些技术需要复杂昂贵的热循环仪和专业操作人员，无法满足发展中国家以及缺乏先进医疗资源的边远地区的需求，更无法满足现场快速诊断的要求。
　　为了解决基于PCR技术的诊断方法需要依赖热循环仪这一问题，目前一些基于等温核酸扩增的技术，例如核酸序列依赖性扩增技术(Nucleic-acid sequencebased amplification，NASBA)、环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）、解旋酶依赖性DNA扩增技术(Helicase-dependent isothermalDNA amplification，HDA)等也被使用到了分子诊断中。等温核酸扩增技术缩短了诊断时间、降低了仪器设备的要求。然而，这些技术也涉及到一些急需解决的问题，如NASBA仅仅适用于RNA分析并且涉及多个酶反应步骤，LAMP需要复杂的引物设计而且无法依据产物大小分析扩增产物，HDA所需有的解旋酶容易受到样本的抑制等。这些问题都影响到了检测方案的稳定性和应用的广泛性，削弱了等温扩增技术在分子诊断上的优势。
　　本研究构建了一种基于胶体金以及核酸酶辅助的等温信号扩增的多重基因分型的方法。我们利用这种方法对人类细胞色素P4502D6酶基因CYP2D6*4的多态性位点进行了多重基因分型，整个分析过程为15分钟，灵敏度为100 aM，线性范围为10 fM到100 nM。与传统的基于PCR技术的核酸分析方法相比，此方法不需要热循环仪，反应速度快，灵敏度高，检测成本低，而且操作简单，既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测的灵敏度。这些特点和优势使其可用于医院的床边诊断，进而快速分析药物代谢基因，对药物进行个性化评估，从而个性化选择药物种类和用药剂量，进行个性化指导治疗。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

1．个体化用药

1．1 个体化用药的概念

1．2 个体化用药的由来

1．3 药物基因组学与个体化用药

1．4 当前个体化用药发展面临的主要问题

1．5 小结

2．细胞色素P450家族和CYP2D6基因的简介

2．1 细胞色素P450家族的多样性

2．2 CYP2D6的简介

2．3 小结

3．基因多态性的常规检测方法

3．1 聚合酶链式反应(PCR)其衍生技术

3．2 核酸等温扩增技术

4．现场诊断技术

4．1 芯片实验室(Lab on a chip，LOC)

4．2 依赖于胶体金的现场检测技术

5．本课题研究的内容和意义

实验原理与方法

1．实验原理

2．技术路线

3．实验方法

3．1 实验材料与仪器

3．2 实验方法

结果与讨论

1 胶体金制备结果

2．NASDP-LFB检测体系的优化

2．1 LFB检测体系的优化

2．2 NASDP反应体系的优化

2．3 NASDP-LFB检测体系的灵敏度分析

2．4 NASDP-LFB检测体系的特异性分析

2．5 NASDP-LFB检测体系对CYP2D6进行基因分型

讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文