基于工具酶信号放大的核酸等温扩增检测新方法研究

摘要

随着分子生物学的发展，核酸扩增检测技术得到迅速发展。PCR技术是目前广泛应用的核酸扩增检测技术之一。但是，该技术对温度条件依赖，需要复杂的变温设备，以及实验环境苛刻，难以满足人们对简便、快速、易操作的分析技术的需求。结合高效工具酶建立起来的等温核酸扩增技术弥补了这些不足，在现场分析和应急事件中表现出来的优势越来越明显。
　　本论文中构建了两种基于工具酶的等温核酸检测新方法。在第二章中结合分子信标构建了一种反应快速，体系简便的用于microRNA检测的方法，并且以microRNA Let-7a为靶标对方法进行了验证。该方法通过带有酶切位点的分子信标，在两种工具酶的作用下利用链置换原理实现了检测信号的两重循环放大。利用此方法对不同浓度的Let-7a靶标进行检测，在浓度范围10zmol-1 fmol，表现出良好的线性关系，最低检测限为8.5×10-15M，并且对人脑全RNA检测中表现出较好的实用性。
　　针对目前大部分生物体内核酸是以DNA双链形式存在的情况，在第三章中从设计的三个方案中优选一种单引物核酸等温扩增检测双链DNA方法。此方法首先借助切刻内切酶对双链DNA特异识别产生切口，利用具有链置换活性的聚合酶将双链DNA线性转换成单链DNA靶标，以扩增的单链靶标为模板设计单引物进行三重荧光信号的实时放大反应。此方法以PBS质粒DNA对实验条件进行了优化，在最优条件下，实现了1.0×10-13 M的靶标的灵敏检测。此方法中只需设计一条引物分子，方法体系简单，反应快速，以期能很好的应用于进行现场检测。
　　综上所述，本论文构建了两种基于工具酶的等温核酸扩增检测方法，这些方法将为各种突发事件和现场的核酸样品的分析检测提供简便、灵敏、特异的工具。

目录

摘要

第一章 综述

1．1 基于工具酶的核酸扩增检测技术

1．1．1 PCR技术

1．1．2 等温核酸扩增检测技术

1．1．3 核酸的信号表征

1．2 基于microRNA检测的核酸信号放大技术

1．2．1 杂交技术用于miRNA检测

1．2．2 变温扩增技术用于miRNA检测

1．2．3 等温扩增技术用于miRNA检测

1．3 基于双链DNA检测的核酸信号放大技术

1．3．1 PCR技术用于双链DNA检测

1．3．2 等温扩增技术用于双链DNA检测

1．4 本论文的研究意义与主要内容

第二章 用于miRNA检测的工具酶等温核酸扩增新方法研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．2．3 荧光信号检测表征

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验原理

2．3．2 DNA条件优化

2．3．3 方案可行性验证

2．3．4 实验条件优化

2．3．5 靶标检测实验

2．4 小结

第三章 用于双链DNA检测的等温核酸扩增新方法研究

3．1 引言

3．2 实验设计

3．2．1 实验设计方案一

3．2．2 实验设计方案二

3．2．3 实验设计方案三

3．3 实验部分

3．3．1 仪器与试剂

3．3．2 DNA提取

3．3．3 实时荧光检测

3．4 结果与讨论

3．4．1 信标分子配比

3．4．2 实验方案验证

3．4．3 实验条件优化

3．4．4 灵敏度检测

3．4．5 背景问题论证

3．5 小结

结论

参考文献

致谢

附录：攻读硕士学位期间发表的论文目录

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