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英文缩略表
图表目录
第一章 绪论
1.1 里氏木霉表达系统
1.1.1 里氏木霉简介
1.1.2 里氏木霉分泌的内源酶
1.1.3 里氏木霉异源蛋白表达策略
1.2 里氏木霉转化体系
1.2.1 优良的宿主菌
1.2.2 里氏木霉的转化
1.2.3 里氏木霉的筛选标记
1.3 里氏木霉遗传操作体系简介
1.3.1同源重组
1.3.2 RNAi技术
1.3.3 CRISPR/Cas9系统
1.4β-葡萄糖苷酶
1.4.1β-葡萄糖苷酶简介
1.4.2β-葡萄糖苷酶的应用
1.5β-甘露聚糖酶
1.5.1β-甘露聚糖酶简介
1.5.2β-甘露聚糖酶的应用
1.6 本研究的内容及意义
第二章 结合CRISPR/Cas9和RNAi技术同时对主要纤维素酶cbh1和eg2基因进行编辑
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 培养基与溶液配制
2.1.3 实验仪器与生化试剂
2.1.4 引物
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养
2.2.2 里氏木霉总DNA的提取
2.2.3 pEG2i质粒的构建
2.2.4 gRNA-cbh1的制备
2.2.5 里氏木霉转化
2.2.6 阳性转化子的筛选
2.2.7 纤维素酶的诱导表达
2.2.8 SDS-PAGE及质谱分析
2.2.9 里氏木霉总RNA的提取
2.2.10基因转录水平的测定
2.2.11 纤维素酶酶活的测定
2.3 结果与分析
2.3.1 Cas9/gRNA复合物敲除里氏木霉cbh1基因
2.3.2 选定转化子中CBH1和EG2分泌表达情况
2.3.3 eg2基因转录水平分析
2.3.4 质谱鉴定
2.4 讨论
第三章 低纤维素酶背景促进β-葡萄糖苷酶在里氏木霉中的异源表达
3.1 试验材料
3.1.1 菌株和质粒
3.1.2 培养基与溶液配制
3.1.3 实验仪器与生化试剂
3.1.4 引物
3.2 实验方法
3.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养
3.2.2 pyr4筛选标记的敲除
3.2.3 表达外源基因载体转化里氏木霉
3.2.4 阳性转化子的筛选
3.2.5 异源β-葡萄糖苷酶和异源甘露聚糖酶基因的诱导表达
3.2.6 SDS-PAGE检测目的蛋白的分子大小
3.2.7β-葡萄糖苷酶的酶活测定
3.2.8 甘露聚糖酶的酶活测定
3.3 结果与分析
3.3.1β-葡萄糖苷酶基因NfBgl3A的异源表达
3.3.2 AnMan5A(opt)在里氏木霉中的异源表达
3.4 讨论
第四章 木糖苷酶xyl3A和纤维素酶基因cbh2、eg1的敲除
4.1 试验材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 培养基与溶液配制
4.1.3 实验仪器与生化试剂
4.1.4 引物
4.2 实验方法
4.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养
4.2.2 里氏木霉总DNA的提取
4.2.3 使用CRISPR/Cas9敲除xyl3A基因
4.2.4 Cas9/gRNA RNP复合物分别敲除cbh2和eg1基因
4.2.4 里氏木霉转化
4.2.5 阳性转化子的筛选
4.2.6 纤维素酶的诱导表达
4.2.7 SDS-PAGE检测目的蛋白的分子大小
4.2.8 pyr4筛选标记的敲除
4.3 结果与分析
4.3.1 使用胞内表达Cas9方法敲除xyl3A基因
4.3.2 SUS7菌株中分别敲除cbh2和eg1基因
4.4 讨论
第五章 不同CRISPR/Cas9基因组编辑方法在里氏木霉中的应用探索
5.1 试验材料
5.1.1 菌株和质粒
5.1.2 培养基与溶液配制
5.1.3 实验仪器与生化试剂
5.1.4 引物
5.2 实验方法
5.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养
5.2.2 里氏木霉总DNA的提取
5.2.3 设计II型启动子驱动gRNA
5.2.4 5S rRNA启动子用于引导gRNA的高效表达
5.2.5 应用Cas9(D10A)突变体进行基因编辑
5.2.6 应用小分子调节CRISPR/Cas9的基因编辑效率
5.2.7通过添加非同源DNA来增加基因的破坏效率
5.2.8 利用热胁迫提高CRISPR/Cas9的基因编辑效率
5.2.9 里氏木霉转化
5.2.10 阳性转化子的筛选
5.2.11 纤维素酶的诱导表达
5.2.12 SDS-PAGE检测目的蛋白的分子大小
5.3 结果与分析
5.3.1 使用II型启动子驱动gRNA的表达
5.3.2 使用5S rRNA启动子引导gRNA表达
5.3.3 应用Cas9(D10A)突变体进行基因编辑
5.3.4 使用小分子化合物调节CRISPR/Cas9介导的同源重组效率
5.3.5添加非同源DNA来增加基因的编辑效率
5.3.6 利用热胁迫尝试提高CRISPR/Cas9的基因编辑效率
5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
中国农业科学院;
