西瓜噬酸菌hrcQ、abmR和abmK基因功能分析

摘要

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch，BFB)由革兰氏阴性细菌——西瓜噬酸菌(Acidovorax citrullt)引起，该病害是威胁世界西甜瓜产业的一种毁灭性的种传病害。它可以在西瓜和甜瓜上快速传播并造成严重损失，同时也可以危害其它葫芦科作物，如:黄瓜、南瓜等。　　Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system，T3SS)和双组分信号传导系统(two-component signal transduction system，TCSTS)是革兰氏阴性细菌的关键毒力因子，二者可以参与并调节多种反应，如生理生化反应和细胞的生命活动等。为明确Ⅲ型分泌系统基因hrcQ、双组分传导系统基因abmK和abmR对西瓜噬酸菌的影响，本文分别构建了三者的敲除载体，通过同源重组方法筛选得到△hrcQ、△abmK和△abmR突变菌株，将突变株与野生菌株和互补菌株一同进行致病性及与致病能力相关的一系列表型测定，并通过实时荧光定量对相关基因的表达量进行了分析。　　结果显示　　(1)hrcQ、abmK和abmR生物信息学分析　　HrcQ仅含有一个FliMN结构，Abmk中含有TM、PAC、HisKA、HATPase和REC结构域，AbmR中含有REC、AAA+及HTH结构域。疏水性及跨膜结构预测分析显示，HrcQ和AbmR中不存在跨膜结构，AbmK中存在两个跨膜结构。系统发育树表明，西瓜噬酸菌中的HrcQ、AbmK和AbmR蛋白分别与青枯菌的HrcQ、SsrA和AtoC蛋白亲缘最近。AbmK和AbmR的氨基酸序列与黄单胞菌及其他病原菌中的双组分系统蛋白的氨基酸序列同源性较高，符合双组分系统的结构模式。　　(2)△hrcQ、△abmK和△abmR突变菌株及互补菌株的构建及致病表型测定　　通过构建自杀性重组质粒和互补载体质粒，筛选到突变株△hrcQ、△abmK和△abmR及相应的互补菌株。致病表型测定结果表明:△hrcQ丧失了引起烟草过敏性反应的能力，及寄主致病力，此外，突变菌株的运动能力、生物膜形成能力以及体内生长能力均下降。△abmK和△abmR的致病能力与野生型相比显著降低，运动能力及生物膜形成能力等均有不同程度的下降，但abmK和abmR基因缺失后不影响烟草过敏性反应及体外生长能力。同时，我们发现，突变菌株△abmK中的致病能力下降程度明显大于△abmR。　　(3)hrcQ、abmK和abmR基因缺失对致病相关基因表达量的影响　　hrcQ、abmK和abmR与T3SS基因（hrpG、hrpX、hrpE、hrcR和hrcJ等）、鞭毛基因（fliA）、趋化性基因（cheA）和群体感应基因（luxR）在转录水平中存在调控关系。而鞭毛、趋化性和群体感应基因均与菌株的运动能力、生物膜形成能力以及致病能力有着密切关系，推测hrcQ、abmK和abmR可能是影响了以上这些基因的表达，进而对致病表型产生影响。　　综上所述，hrcQ决定着西瓜噬酸菌的致病性和致敏性，abmK和abmR与多种致病表型存在相关性，二者可能为双组分系统基因，hrcQ、abmK和abmR与多种致病相关基因均存在调控关系。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 瓜类细菌性果斑病及其病原菌概述

1．1．1 瓜类细菌性果斑病

1．1．2 瓜类细菌性果斑为害症状

1．1．3 瓜类细菌性果斑病病原菌

1．1．4 西瓜噬酸菌的检测鉴定

1．1．5 瓜类细菌性果斑病的防治方法

1．2 细菌Ⅲ型分泌系统

1．2．1 细菌分泌系统概述

1．2．2 细菌Ⅲ型分泌系统概述

1．2．3 其他分泌系统

1．2．4 Ⅲ型分泌系统基因hrcQ

1．3 细菌双组分信号传导系统

1．3．1 双组分信号传导系统简介

1．3．2 双组分信号传导系统的结构

1．3．3 双组分信号传导系统的传导方式

1．3．4 双组分信号传导系统调控病原菌的致病力

1．4 立题依据

1．5 研究目的及意义

第二章 生物信息学分析

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 西瓜噬酸菌hrcQ、abmK和abmR基本信息

2．2．2 西瓜噬酸菌HrcQ、AbmK和AbmR结构域预测

2．2．3 西瓜噬酸菌HrcQ、AbmK和AbmR疏水性分析

2．2．4 西瓜噬酸菌HrcQ、AbmK和AbmR跨膜结构域预测

2．2．5 西瓜噬酸菌HrcQ、AbmK和AbmR系统发育树构建

2．2．6 西瓜噬酸菌AbmK和AbmR同源性分析

2．3 结果与分析

2．3．1 西瓜噬酸菌hrcQ生物信息学分析

2．3．2 西瓜噬酸菌abmK和abmR生物信息学分析

2．4 小结与讨论

第三章 突变菌株构建及功能研究

3．1 试验材料

3．1．1 试验菌株及质粒

3．1．2 主要仪器及设备

3．1．3 试剂及抗生素

3．1．4 所用培养基

3．1．5 植物材料

3．2 试验方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 构建突变株△hrcQ、△abmK及△abmR

3．2．3 互补菌株的构建及筛选

3．2．4 致病性测定

3．2．5 烟草过敏性反应测定

3．2．6 运动能力测定

3．2．7 生物膜形成能力测定

3．2．8 生长能力测定

3．3 结果与分析

3．3．1 构建自杀性重组载体和互补载体

3．3．2 突变株及互补菌株筛选

3．3．3 致病性测定结果

3．3．4 烟草过敏性反应测定结果

3．3．5 运动能力测定结果

3．3．7 生长能力测定结果

3．4 小结与讨论

第四章 突变菌株致病相关基因表达量分析

4．1 试验材料

4．1．1 试验菌株

4．1．2 试剂与仪器

4．2 试验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 引物检测

4．2．3 供试菌株总RNA提取

4．2．4 供试菌株总RNA反转录

4．2．5 荧光定量反应

4．2．6 基因相对表达量分析

4．3 结果与分析

4．3．2 △abmK和△abmR中致病相关基因表达量分析

4．4 小结与讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历