黄瓜花叶病毒侵染与烟草细胞自噬相关性的研究

摘要

细胞自噬(Autophagy)是真核细胞中一种高度保守的降解细胞组分的生理过程，在应对营养缺失、疾病、衰老等方面发挥重要作用。细胞自噬与病毒互作成为近年来的研究热点，目前烟草上三大主要病毒中，普通烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)与烟草细胞自噬的相关性已有研究，而关于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)侵染烟草对细胞自噬的调控显见报道。因此，为明确黄瓜花叶病毒CMV是否能够引起细胞自噬，本文对CMV和烟草细胞自噬的相关性进行了研究。　　为方便准确检测烟草的细胞自噬，本研究首先构建了青色荧光标记(cyan fluorescence protein，CFP)与烟草细胞自噬标志基因ATG8f相融合的转基因植株Nb-CFP-ATG8f通过缺C或缺N实验诱导植株产生细胞自噬，验证了Nb-CFP-ATG8f能够稳定有效表达CFP，可作为监测烟草细胞自噬的研究材料。以CMV和Nb-CFP-ATG8f为主要实验材料，利用激光共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)、透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)、Western Blot技术和荧光定量PCR(qRT-PCR)方法，分析CMV侵染对烟草细胞自噬流、细胞自噬显微结构，以及自噬相关蛋白LC3(ricrotubule-associated proteinllight chain3，LC3)、P62(ubiqutin-binding protein，P62)和自噬相关基因表达特征的影响。结果表明:　　1、激光共聚焦结果显示，与PBS处理的对照植株相比，CMV侵染后可在叶片中观察到明显的青色荧光标记的自噬体。电镜结果进一步显示，CMV侵染后叶片细胞内线粒体、叶绿体、细胞核膜等细胞器出现不同程度的破坏和降解，细胞空泡化现象严重，同时细胞内出现微自噬和巨自噬结构。表明CMV侵染引起烟草能够引起寄主的细胞器降解，并诱发细胞自噬。　　2、同时利用Western Blot对细胞自噬两大标记蛋白LC3和P62的动态变化进行了检测，结果表明，随着CMV侵染时间增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，而P62表达水平正好呈现相反趋势，随着自噬发生其表达量降低。证明CMV侵染烟草可以引起相关蛋白表达量变化，诱发寄主细胞自噬。　　3、为进一步验证CMV侵染对寄主细胞自噬信号传导途径的调控，本研究利用qRT-PCR对CMV侵染胁迫下烟草细胞自噬相关基因的表达进行了定量检测，结果表明，CMV侵染后0h、24h、48h、72h、96h和120h，CMV病毒表达量持续增加，细胞自噬相关基因NtATG1a、NtATG1b、NtATG3、NtATG4、NtATG8a、NtATG8b、NtATG8c、NtATG8d、NtATG9、NtATG10、NtATG13a、NtATG13b、NtATG18a、NtATG18c、NtATG18d、NtATGVTL12、NtATGVPS34的变化趋势与CMV病毒表达量变化一致，均表现为上调趋势。该结果揭示CMV侵染引起寄主细胞自噬信号传导途径的参与，暗示细胞自噬可能参与了CMV侵染复制和致病过程。

目录

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摘要

第一章 引言

1．1 细胞自噬概述

1．2．1 自噬的种类

1．2．2 自噬的过程

1．2．3 自噬相关基因和自噬相关蛋白

1．3 黄瓜花叶病毒的研究进展

1．4 自噬在非生物胁迫中的地位

1．5 细胞自噬与动植物免疫之间的关系

1．6 细胞自噬对植物程序性死亡的控制

1．7．3 特异性分子标记

1．7．6 自噬相关基因转录水平检测

1．8 研究内容与目的意义

第二章 构建Nb-CFP-ATG8f转基因植株

2．1 实验材料

2．1．4 供试烟草及培养条件

2．2．1 转基因植株Nb-CFP-ATG8f的构建

2．2．2 转基因植株Nb-cFP-ATGf的筛选和验证

2．2．4 电镜样品的制备

2．3 实验结果

2．3．2 Nb-CFP-ATG8f转基因植株的筛选和验证

2．3．3 饥饿条件诱导自噬体的观察

2．3．4 饥饿诱导自噬体亚细胞结构的观察

2．4 讨论

第三章 CMV侵染能够引起烟草的细胞自噬

3．1 实验材料

3．1．4 供试烟草材料及CMV病毒

3．2 实验方法

3．2．2 Westem Blot检测LC3和P62蛋白的方法

3．2．3 自噬相关基因检测

3．3 实验结果

3．3．1 CMV侵染后烟草细胞自噬诱导观察

3．3．2 CMV侵染后烟草亚细胞结构的研究

3．3．3 CMV侵染对烟草LC3和P62的表达影响

3．3．4 CMV侵染对烟草细胞自噬相关基因表达特征分析

3．4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历