PVY侵染对烟草过氧化物酶体自噬的调控研究

摘要

细胞自噬参与抵抗营养不足、疾病和衰老等过程，在此过程中一些错误折叠的蛋白质及受损的细胞器会被分解，降解后的成分得以循环利用。本研究以细胞自噬作为研究的切入点，重点围绕马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)侵染烟草能够引起细胞自噬及过氧化物酶体自噬开展了一系列研究。 为验证PVY侵染是否激活寄主细胞自噬，本研究以PVY、PVY-GFP-S和Nb-CFP-ATG8f转基因植株为研究材料，以PVY侵染烟草为处理，以等量的PBS处理为对照，通过激光共聚焦显微镜观察到PVY侵染烟草后有发光的自噬小体，且数量显著高于对照，暗示PVY侵染烟草可以引起细胞自噬;为进一步验证PVY侵染寄主可以引起细胞自噬，利用Western Blot检测细胞自噬分子marker ATG8蛋白表达，结果表明PVY侵染烟草可以提高寄主ATG8蛋白含量;利用TEM进一步观察了PVY侵染对烟草细胞病理学的影响，结果显示PVY侵染烟草可以引起胞内过氧化物酶体中减少、叶绿体及淀粉粒的变化、自噬体在液泡降解等;为进一步验证细胞自噬对PVY侵染复制的影响，利用基因沉默自噬基因ATG6和ATG7，烟草叶片的PVY-GFP荧光面积均大于对照，运用荧光定量PCR检测到自噬基因ATG6和ATG7的表达量上调且在激光共聚焦下自噬小体的荧光蛋白含量明显多于对照，说明PVY侵染可以引起细胞自噬。 在电镜观察结果中发现疑似过氧化物酶体自噬过程。为进一步验证PVY侵染对寄主选择性自噬“过氧化物酶体自噬”的影响，本研究首先构建了过氧化物酶体SKL-RFP融合蛋白和过氧化氢酶CAT1-YFP融合蛋白，用于分析PVY侵染烟草对过氧化物酶体数量的影响，激光共聚焦观察结果显示PVY侵染烟草可显著降低过氧化物酶体SKL-RFP荧光点，CAT1-YFP由分散状态到聚集至核内，暗示PVY侵染可能引起寄主过氧化物酶体自噬。利用Western Blot技术对PVY侵染烟草后过氧化物酶体自噬分子marker PEX14蛋白检测，结果显示PVY侵染后PEX14蛋白的含量显著降低，表明PVY侵染烟草可引起寄主产生过氧化物酶体自噬。通常认为ROS作为主要的信号分子，激发细胞产生细胞自噬和过氧化物酶体自噬，为此本研究进一步利用荧光染料DCFH-DA胞内标记ROS和NBT组织染色标记ROS两种技术分别检测寄主胞内ROS的变化，表明PVY侵染烟草可引起胞内ROS含量增多，同时产生细胞自噬和过氧化物酶体自噬;通过NAC（抗氧化剂）处理烟草叶片，可限制胞内ROS的产生，同时细胞自噬和过氧化物酶体自噬也受到抑制;利用H2O2处理烟草叶片，发现胞内ROS含量上升，细胞自噬和过氧化物酶体自噬信号加强。基于上述研究，表明PVY侵染烟草引起的细胞自噬和过氧化物酶体自噬，ROS作为信号分子参与调控。