中东呼吸综合征冠状病毒受体结合的分子机制研究

摘要

冠状病毒（coronavirus）是一类广泛存在的、对人及家畜具有重大潜在威胁的病原体。该种病毒具有广泛的组织亲嗜性，是所有RNA病毒中基因组最大的病毒（基因组约有30kb）。2012年9月在中东发现的中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）可以引起人体严重的肺部疾病，其临床表现为急性呼吸窘迫综合征，并伴有多器官功能衰竭，是继SARS-CoV之后的第二大高致病性冠状病毒。该病毒自2012年9月被确认，截至今年5月8日，共有536例确诊病例，死亡率高达30.7％。因此，MERS-CoV已经成为一种严重威胁人类健康与生命安全的新型冠状病毒。
　　国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将冠状病毒分为四个属:α，β，γ和δ冠状病毒属。β冠状病毒属中有四个亚群(A-D)，通过比对MERS-CoV和其他β冠状病毒基因序列发现，MERS-CoV与SARS-CoV中较为保守的核酸复制酶序列仅有小于50％的氨基酸相同，而与从蝙蝠分离到的HKU4和HKU5亲缘关系更近，因此，ICTV将MERS-CoV归为β冠状病毒属C亚群的一个新种，也是第一种能感染人类的C亚群β冠状病毒，而SARS-CoV则属于β冠状病毒属B亚群。
　　刺突蛋白(Spike glycoprotein，S)是冠状病毒表面参与受体结合、膜融合和病毒侵入宿主细胞的主要膜蛋白，也是宿主中和性抗体的主要靶分子。成熟的S蛋白通常会在宿主蛋白酶的作用下裂解成两个亚基:S1和S2。其中，S1负责受体的识别，而S2启动病毒与宿主的膜融合。S1亚基又包括两个相对独立的区域，N-端结构域(N-terninal domain，NTD)和C-端结构域(C-terminal domain，CTD)，不同的冠状病毒通常利用这两个结构域之一作为病毒的受体结合区（recepter binding domain，RBD）。S蛋白与病毒的高致病性密切相关，也是宿主选择性的决定性因素之一。有研究表明，冠状病毒的S蛋白能够识别细胞表面的蛋白和一些糖脂的糖基，如5-N-羟乙酰神经氨酸和5-N-乙酰神经氨酸等，作为病毒的受体或共受体。目前已有两类宿主酶蛋白被鉴定为冠状病毒的受体，包括血管紧张素转换酶2(ACE2)作为SARS-CoV和人类冠状病毒HCoV-NL63的受体，氨肽酶N(APN)作为猪呼吸冠状病毒PRCV的受体。有关这些受体和病毒S蛋白的相互作用模式都得到了详细的阐述。
　　我们首先利用哺乳动物细胞表达了MERS-CoV S蛋白的S1亚基、S1亚基的NTD和CTD的Fc融合表达蛋白。用流式方法检测了这三种蛋白与表达在BHK细胞表面的CD26分子的结合。结果显示S1蛋白和S1蛋白的CTD结合CD26分子，而S1蛋白的NTD不结合。这表明MERS-CoV S蛋白的受体结合区位于S1蛋白的C端，由此我们将该区域定义为MERS-CoV RBD。然后，我们用杆状病毒表达系统表达了MERS-CoV RBD蛋白，并解析了其晶体结构。结构显示MERS-CoV RBD结构由一个核心区和一个外展区域构成，核心区与先前解析的SARS-CoV的RBD有极高的结构相似性，而外展区结构则完全不同。我们进一步用杆状病毒表达系统表达了CD26的胞外段蛋白，并通过实时表面等离子共振技术测定了MERS-CoV RBD和CD26之间的亲和力，KD=16.7 nM，随后MERS-CoV RBD与CD26复合体晶体结构也被成功解析。结构显示:MERS-CoVRBD以其外展区域与CD26分子的“β-螺旋桨样”结构域结合，呈现出一种典型的反式互作模式。CD26分子以二聚体形式存在于细胞表面，每个CD26分子结合一个MERS-CoV RBD;而两者的结合主要是通过一系列亲水氨基酸介导的氢键和盐桥实现的。进一步分析表明，MERS-CoV RBD在CD26分子上的结合位点与ADA在CD26中的识别位点高度重叠。因ADA作为CD26的天然配体，在T细胞激活过程中发挥重要作用，因此，我们的结果暗示MERS-CoV S蛋白对CD26的结合很可能对细胞免疫具有一定的影响。
　　在本研究中，我们对MERS-CoV NTD以及SARS-CoV NTD的结构与功能进行了初步探索。任何病毒入侵宿主细胞时都需要特异的病毒配体与宿主受体的识别和互作，而这一相互作用在很大程度上决定了此种病毒的组织亲嗜性和人群易感性。因此，MERS-CoV RBD与其受体的复合物结构的解析，为以此为结构基础的小分子抑制剂的设计，以及以RBD为基础的预防性疫苗的设计，都具有重要的指导意义。这将为预防像SARS、MERS这样的突发性传染病建立良好的预报预警机制，从而在应对冠状病毒再次引起的突发公共卫生事件提供帮助。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 冠状病毒概述

1．1．1 冠状病毒结构

1．1．2 冠状病毒各蛋白的功能

1．1．3 冠状病毒生命周期与基因组复制

1．1．4 冠状病毒流行病学及研究现状

1．2 中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)概述

1．2．1 MERS-CoV结构

1．2．2 MERS-CoV的发现、命名与分类

1．2．3 MERS-CoV致病机理

1．2．4 MERS-CoV系统发育与流行病学

1．2．5 MERS-CoV宿主分析

1．2．6 MERS-CoV研究现状

1．3 MERS-CoV功能性受体CD26的功能简述

第二章MERS-CoV RBD的发现、鉴定和结构解析

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 主要化学试剂

2．2．2 细胞系，质粒载体

2．2．3 其他实验材料

2．2．4 主要实验仪器

2．2．5 常用溶液配方

2．3 实验方法

2．3．1 重组基因的设计合成

2．3．2 应用位点特异性重组策略克隆重组基因至重组昆虫杆状病毒载体Bacmid

2．3．3 Bacmid转染昆虫细胞Sf9及重组杆状病毒的扩增

2．3．4 Westem blot检测目的蛋白的表达

2．3．5 用确认了滴度的病毒感染昆虫细胞表达蛋白及蛋白的纯化

2．3．6 蛋白晶体生长条件的筛选

2．3．7 重金属原子结合法Native-page

2．3．8 蛋白晶体数据收集及晶体结构解析

2．4 实验结果

2．4．1 MERS-CoV RBD的鉴定

2．4．2 MERS-CoV RBD蛋白的表达与纯化

2．4．3 RBD蛋白晶体生长条件的筛选

2．4．4 MERS-CoV RBD的重原子结合实验

2．4．5 MERS-CoV RBD蛋白的结晶，数据收集和处理

2．5 分析与结论

2．5．1 MERS-CoV RBD整体结构

2．5．2 MERS-CoV RBD与典型的β-冠状病毒S蛋白同源区的比较

2．6 本章小结

第三章 MERS-CoV RBD与受体CD26相互作用机制的研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 MERS-CoV RBD蛋白的表达和纯化

3．3．2 CD26蛋白的表达和纯化

3．3．3 MERS-CoV RBD和CD26的体外结合

3．3．4 SPR测定MERS-CoV RBD与CD26分子间亲和力

3．3．4 MERS-CoV RBD和CD26的共结晶

3．3．5 复合物蛋白晶体生长条件的筛选

3．3．6 复合物晶体x射线衍射数据收集与晶体结构解析

3．4 实验结果

3．4．1 重组蛋白的表达和纯化

3．4．2 MERS-CoV RBD与CD26的体外结台

3．4．3 MERS-CoV RBD与CD26的亲和力测定

3．4．4 MERS-CoV RBD和CD26共结晶

3．4．5 MERS-CoV RBD／CD26复合体晶体X射线衍射和晶体数据收集

3．4．6 流式细胞仪检测验证MERS-CoV RBD与CD26的结合特征

3．5 分析与讨论

3．5．1 重组杆状病毒在扩增和表达蛋白过程中感染量的控制

3．5．2 MERS-CoV RBD和CD26复合物整体结构特点

3．5．3 MERS-CoV RBD结合受体前后结构比对

3．5．4 MERS-CoV RBD与CD26结合接触面的特点

3．5．5 与其他冠状病毒S蛋白／受体复合物的结构比较

3．6 本章小结

第四章 MERS-CoV NTD和SARS-CoV NTD结构与功能的初探

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 NTD重组基因的设计合成

4．3．2 利用糖点阵(Glycansmicroarray)技术测定蛋白和受体的结合特异性

4．4 实验结果

4．4．1 MERS-CoV NTD和SARS-CoV NTD重组基因的构建

4．4．2 MERS-CoV NTD重组蛋白的表达与纯化

4．4．3 SARS-CoV NTD重组蛋白的表达与纯化

4．4．4 NTD蛋白晶体生长条件的筛选

4．4．5 重金属原子结合法Native-page

4．4．6 蛋白晶体X-射线衍射与数据收集

4．4．7 糖点阵实验分析

4．4．8 分析与结论

第五章 其他工作

5．1 第一部分

5．1．1 蝙蝠来源的SARS样冠状病毒刺突蛋白受体结合区的结构特征研宄

5．1．2 实验材料

5．1．3 实验方法

5．1．4 实验结果

5．2 第二部分

5．2．1 MERS-CoV S1、S1P(NTD-RBD)以及S-胞外段蛋白的研宄初探

5．2．2 实验结果

第六章 全文总结与课题展望

6．1 全文总结

6．2 课题展望

参考文献

作者简历

致谢