中东呼吸综合征冠状病毒受体结合功能区的免疫保护作用机制研究

摘要

新中东呼吸综合症（MERS）冠状病毒（MERS-CoV）于2012年在沙特地区首次发现，随后，在全世界范围内传播，严重威胁人类健康。MERS病毒感染已经在27个国家地区出现，感染及死亡病例持续增加。截止2017年3月8日，世界卫生组织报告的感染病例死亡病例分别为1917例和677例，病死率高于35％。针对MERS-CoV疫苗研究已广泛开展，目前，多种候选疫苗处于临床前研究阶段，尚无人用MERS疫苗上市。以MERS-CoV刺突糖蛋白（Spike protein,S）受体结合区（Receptor Binding Domain,RBD）为抗原靶点的亚单位疫苗研究不断深入，为MERS-CoV蛋白关键免疫保护功能区。前期研究中，针对免疫有效功能区段的优化，免疫方案确定及免疫保护特性等方面进行了深入的研究。但对于MERS-CoV RBD疫苗的免疫机制研究，仍存在一些问题需解答，例如，自2012年首次发现以来，经历5年的流行及传播，毒株出现多种突变，MERS-CoV RBD区段的突变是否会引起免疫保护能力下降，而导致该区段不再适合作为疫苗研究靶点？是否可以通过模拟MERS-CoV RBD蛋白的天然构象形式，设计MERS-CoV RBD构象优化疫苗，提高免疫保护效果？MERS-CoV RBD区所含免疫功能表位在其诱导免疫保护应答中的作用如何，可否对其进行精确评价？可否通过结构优化，对MERS-CoV RBD非中和免疫优势表位进行封闭，促进中和性免疫应答反应，使其对MERS-CoV产生完全免疫保护？为了回答以上问题，我们设计了以下实验，对MERS-CoV RBD蛋白进行了深入研究，进一步多角度阐明其免疫保护机制。
　　1.MERS-CoV蛋白受体结合功能区诱导的免疫保护作用特征研究
　　依据2012-2015年间，所有不同地区，不同宿主来源的MERS-CoV流行株MERS-CoV RBD区突变情况，利用定点突变的方法，在EMC-RBD基础上，构建5种RBD疫苗株：2012-RBD，2013-RBD，2014-RBD，2015-RBD及Camel-RBD，分别包含2012-2015年度，人源及骆驼源流行代表病毒株RBD区单个或多个突变位点，同时构建表达MERS病毒S蛋白基因的真核载体，用于包装17株2012-2015年代表性的人源及骆驼来源的MERS-CoV假病毒，以及5株单克隆抗体逃逸假病毒株。利用真核蛋白表达系统，成功在293T细胞中，表达该5种MERS-CoV RBD蛋白，并成功包装22株高滴度MERS-CoV假病毒，用于免疫血清交叉中和效果评价。利用免疫共沉淀法，酶联免疫吸附法和细胞流式法鉴定RBD蛋白与MERS-CoV受体DPP4的结合能力，结果表明，MERS-CoV RBD突变蛋白能够有效地结合人源及骆驼来源的DPP4蛋白，且前者强于后者；利用酶联免疫吸附法测定MERS-CoV RBD蛋白与4种中和性单克隆抗体（鼠源单抗：Mersmab1，人源单抗：m336，m337和m338）的结合，结果与EMC-RBD蛋白无显著差异，具有良好的抗原性；MERS-CoV RBD蛋白免疫小鼠血清，能够诱导高水平特异性抗体产生，且对17株2012-2015年代表性的人源及骆驼来源的MERS假病毒，5株单克隆抗体逃逸假病毒株，及2株活病毒具有强的交中和反应。同时设计2种包含MERS-CoV受体结合域（RBM）关键氨基酸位点的RBD蛋白：RBD-FGG和RBD-FGGAA，其功能性，抗原性及所诱导的交叉性中和抗体均有显著减弱，然而，这种免疫逃逸是在MERS-CoV毒力及传播流行能力下降甚至消失的情况下发生，自然情况下，该流行株不能存在，进一步证实了RBD作为亚单位疫苗靶点的可行性。因此，本部分研究证明MERS-CoV RBD作为重要的亚单位疫苗靶点能够诱导高效广谱的交叉保护性免疫，对人及骆驼来源的MERS-CoV流行株有交叉中和作用，为研发安全高效广谱RBD疫苗提供重要的理论基础。
　　2.类天然构象性三聚体MERS-CoV RBD重组蛋白免疫保护作用研究
　　基于第一部分研究结果，位于S蛋白内的RBD区可作为广谱疫苗研究的有效靶点，如何在此基础上提高免疫保护效果，阐明构象性蛋白免疫保护功能区设计机制，成为下一个研究重点。MERS-CoV S蛋白在病毒表面形成天然三聚体结构，本部分研究拟对RBD蛋白进行构象性优化与设计，通过重组融合三聚体形成单位，即Foldon序列，重组表达MERS-CoV RBD-Fd蛋白。以期通过形成三聚体蛋白，模拟病毒表面RBD蛋白天然构象，继而被开发成既能发挥免疫保护功能的疫苗候选蛋白，又能有效阻断病毒感染的治疗性蛋白药物。结果表明：首先，成功在真核系统表达出具有三聚体构象的MERS-CoV RBD-Fd蛋白，且能够与MERS病毒受体DPP4高效结合，能够有效阻断MERS假病毒感染MERS病毒敏感细胞系。其次，动物免疫及血清学检验表明，RBD-Fd蛋白能够有效诱导高滴度的中和抗体的产生，且能够维持长期保护性免疫应答反应。对人DPP4转基因小鼠的活病毒攻毒试验产生良好的保护效果。
　　本部分研究重点强调在以包膜糖蛋白为靶点的亚单位疫苗设计中天然构象性抗原的作用，证明了基于免疫原天然构象的疫苗设计应用于MERS-CoV RBD亚单位疫苗的可行性。为研发RBD为基础的MERS预防及治疗性药物奠定基础。
　　3.MERS-CoV病毒RBD关键位点糖基化修饰对免疫保护作用影响和机制研究
　　本部分研究通过阐明特定表位在MERS-CoV RBD蛋白在诱导机体产生中和保护免疫所发挥的作用，鉴定非中和表位及免疫优势表位，进一步揭示MERS-CoV RBD疫苗免疫保护机制并指导MERS-CoV RBD疫苗及其他病毒性亚单位疫苗的优化设计。基于第一部分和第二部分研究结果，证实RBD存在特定表位的改变所引发的免疫应答发生变化，而基于结构构象的疫苗设计可以应用于RBD蛋白分子。根据MERS-CoV RBD蛋白晶体结构及功能特点，选取4个在MERS-CoV RBD不同的独立表位：Arg511、Ala562、Val403和Thr579。利用定点突变PCR方法在相应位点形成N糖基化基序，在哺乳动物细胞293T中，分别表达并纯化4种突变MERS-CoV RBD蛋白。利用SDS-PAGE和质谱分析的方法鉴定了糖基化的形成。利用AlphaScreen法和流式细胞法分析重组MERS-CoV RBD蛋白与人DPP4蛋白间的结合能力结果显示，位于511位置的糖基化修饰可阻断RBD蛋白与受体DPP4的结合。位于562位置的糖基化修饰可降低MERS-CoV RBD蛋白与受体DPP4的结合。而位于403和579位的糖基化则对RBD与DPP4之间的结合没有影响。实验也分析了糖基化位点的引入对MERS-CoV RBD蛋白抗原性变化（hMS-1，m336-Fab，m337-Fab和m338-Fab）。ELISA结果显示，位于511位的糖基化突变完全阻断了RBD蛋白与Mersmab1的结合，降低了MERS-CoV RBD蛋白对m336-Fab和 m337-Fab的结合。与511位不同，403,562和579位糖基化对MERS-CoV RBD蛋白与任意4种中和性单克隆抗体结合均无显著影响。免疫原性及中和抗体分析显示，与MERS-CoV RBD野生型蛋白相比，分别带有579和511位糖基化表位的MERS-CoV RBD蛋白，前者能够显著提高中和抗体滴度，而后者的中和抗体滴度则显著降低。而分别带有403和562位点糖基化的MERS-CoV RBD蛋白所诱导的中和抗体滴度与野生型相比则没有显著性差别，同时，在活病毒保护性评价中，得到相似结果。为定量地评价表位的中和免疫原性，我们提出一个新的“中和免疫原性指数”（NII）的概念，并定义其为，在某特定表位中，糖基化探针的出现或消失对免疫原诱导中和免疫效应能力的改变的比值。NII可以作为一个有效的评价手段定量地评价MERS-CoV RBD疫苗上特定表位，进一步阐明免疫保护机制，从而指导MERS-CoV RBD疫苗的优化设计。
　　总之，我们的研究在鉴定了MERS-CoV RBD蛋白诱导广谱交叉性中和保护效果的基础上，通过对RBD分子构象性改造，及结构基础的RBD分子修饰提高RBD亚单位疫苗的保护效果，对以结构蛋白为靶点的抗病毒疫苗优化设计提供重要评价方法，进一步揭示了MERS-CoV关键免疫保护功能区的免疫保护作用机制。

目录

缩略词表

前言

第一部分 MERS-CoV蛋白受体结合功能区诱导的免疫保护作用特征研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 MERS-CoV流行株RBD区序列比突变情况分析

2.2 MERS-CoV RBD突变蛋白设计，表达及鉴定

2.3 MERS-CoV RBD重组蛋白抗原性分析

2.4重组RBD蛋白与DPP4受体结合能力的分析

2.5 MERS CoV重组RBD蛋白能够诱导强的特异性交叉反应性抗体

2.6 重组RBD蛋白能够诱导高滴度广谱性中和抗体产生

2.7 受体结合域关键氨基酸位点突变对MERS CoV RBD重组蛋白的影响

3 讨论

第二部分 类天然构象性三聚体MERS-CoV RBD重组蛋白免疫保护作用研究

1.1 材料

1.2方法

2 结果

2.1 MERS CoV RBD-Fd蛋白的表达及鉴定

2.2 MERS CoV RBD-Fd蛋白的抗原性分析

2.3 MERS CoV RBD-Fd蛋白与MERS病毒受体DPP4的结合

2.4 MERS CoV RBD-Fd蛋白能够有效抑制MERS病毒感染

2.5 MERS CoV RBD-Fd蛋白能够诱导产生长效、高滴度特异性抗体

2.6 MERS CoV RBD-Fd蛋白能够诱导交叉反应性中和抗体的产生

2.7 MERS CoV RBD-Fd蛋白能够诱导保护性免疫

3 讨论

第三部分 MERS-CoV病毒RBD关键位点糖基化修饰对免疫保护作用的影响和机制研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2方法

2.1 MERS RBD蛋白特定表位糖基化修饰设计

2.2 MERS RBD蛋白糖基化修饰鉴定

2.3糖基化修饰的MERS RBD蛋白功能鉴定

2.4糖基化修饰的MERS RBD蛋白抗原性变化

2.5 糖基化修饰的MERS RBD蛋白中和免疫原性及保护性试验

2.6 MERS RBD表位中和免疫原性指数（NII）的计算及应用

3 讨论

结论

参考文献

附录

文献综述：新中东呼吸综合征冠状病毒及疫苗研究进展

个人简历

致谢