菟丝子总黄酮对内分泌衰退型小鼠痴呆模型作用以及相关作用机制的研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种渐进行性神经系统退化性疾病，又被称为老年痴呆，其主要的临床表现为认知功能障碍[1-3]。流行病学调查表明[4]，AD的发病率也随着人们的年龄增加而升高，中老年人患老年痴呆的概率越来越高，这对家庭和社会将产生沉重的影响和负担。此病发病隐匿，并且目前国内外的市场上尚且没有根治AD的特效药[5]。因此研究AD的发病机制以及治疗AD药物已刻不容缓。菟丝子，别名吐丝子（Cuscuta chinensis Lam），属于旋花科菟丝子属，是中国的传统中药。其主要成分菟丝子总黄酮(total flavonoidsfrom semen cuscutae，TFSC)在改善内分泌功能方面的药理作用显著，但其有关预防女性更年期AD的报道较少，本研究主要研究菟丝子总黄酮对内分泌衰退型痴呆小鼠的药理作用以及相关的作用机制。
　　目的:
　　研究与探讨菟丝子总黄酮(TFSC)对内分泌衰退型痴呆模型小鼠的记忆能力和神经细胞凋亡的影响及其作用机制。
　　方法:
　　实验中，我们将50只小鼠进行随机性分组:包括模型组，雌激素对照组（Estrogen，E2组），TFSC低剂量组，TFSC中剂量组和TFSC高剂量组，每组10只。手术时，从小鼠的背部进行手术并切除雌性小鼠的双侧卵巢。另外，取10只同样健康的小鼠进行手术，但是仅切开皮肤并缝合，作为假手术对照组，进而建立内分泌衰退型的痴呆小鼠模型。手术后的第4d，各组小鼠进行为期三个月灌胃给药。给药结束后利用阴道上皮细胞染色，检测模型的建立是否成功;采用Moms水迷宫方法检查小鼠的行为学变化;分析天平称量小鼠子宫重量的变化;利用放射免疫法去检测小鼠血清雌激素水平的改变;采用HE染色和尼氏体染色检测小鼠海马区神经细胞病理形态的改变;流式细胞仪法检测各组小鼠神经细胞凋亡率的变化;Western blotting法检测各组小鼠的大脑凋亡相关蛋白的表达量的改变;采用RT-PCR法检测各组小鼠大脑神经细胞中凋亡相关凋亡基因表达的改变。
　　结果:
　　1.TFSC对小鼠子宫重量的影响:与假手术组和雌激素组组相比较，模型组小鼠子宫重量显著下降(P＜0.01);与模型组相比，菟丝子总黄酮各剂量组小鼠子宫重量明显增加，两者差异性有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　2.伊红染色检测阴道上皮细胞形态:与假手术组和雌激素对照组相比，模型组阴道上皮细胞无角质化细胞，细胞呈圆点状。与模型组相比，菟丝子总黄酮各剂量组阴道上皮细胞出现角质化细胞，无圆点状细胞。
　　3.Morris水迷宫实验检测学习记忆:与假手术组和E2组相比较，模型组小鼠的潜伏逃逸期和游泳路程呈明显增加趋势，穿越平台的次数也大幅度地降低，其差异性有统计学意义(P＜0.01);连续用药三个月后，与模型组小鼠相比较，TFSC各剂量组的小鼠潜伏逃逸期和游泳路程显著降低，穿越平台的次数也显著性升高，两者差异性有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　4.放射免疫法测量血清E2含量:与假手术对照组和雌激素组相比，模型组各小鼠血清雌激素的含量下降明显，其差异性有统计学意义(P＜0.01);与模型组相比，菟丝子各剂量组血清雌激素水平明显增加，但与假手术组相比还有一定差距。两者差异性有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　5.HE和尼氏体染色检测神经细胞病理变化: HE染色的结果可知:假手术组小鼠的海马CA1区神经细胞数目丰富，神经元形态饱满，排列整齐，核浆明显，细胞核呈圆形，核仁较为明显;模型组小鼠海马CA1区神经元细胞排列紊乱，较多的神经元胞体缩小，CA1区神经细胞较多的发生了核固缩，神经元的数目也显著减少，胞浆中的空泡大大增加;E2组的小鼠海马CA1区神经细胞排列较模型组整齐，胞浆空泡较模型组明显变小，神经元数量显著增加;高剂量组小鼠海马神经细胞数目较多，排列较模型组整齐，胞浆空泡与模型组相比明显的变小，神经元数量较模型组有明显的增加;中剂量组小鼠海马CA1区细胞排列较整齐，神经元胞体缩小，核固缩，胞浆空泡变小，神经元数量较模型组有所增加;低剂量组小鼠海马CA1区细胞排列很疏松并且数目较少，神经元胞体显著缩小，发生核固缩，胞浆空泡甚至与模型组无多大区别。尼氏体染色法:假手术组小鼠大脑海马区神经细胞丰富，排列规则，尼氏体丰富;模型组小鼠神经细胞排列混乱，尼氏体不清楚，染色不均匀，细胞肿胀较多，坏死细胞较多;雌激素组小鼠大脑海马区神经细胞数目较多，排列整齐，尼氏体较为丰富，胞浆较丰富，形态较完整;高剂量组小鼠神经细胞排列规则，数目较多，尼氏体较为丰富，形态相比模型组较为完整;中剂量组小鼠海马区神经细胞数目较模型组多，部分细胞发生肿胀，细胞染色较均匀;低剂量组小鼠神经细胞数目较少，排列不规则，尼氏体不清晰，部分细胞肿胀，坏死细胞较多。
　　6.流式细胞仪检测细胞凋亡率:与假手术组和雌激素对照组小鼠相比，模型组小鼠大脑神经细胞凋亡率升高显著，其差异性有统计学意义(P＜0.01);药物组小鼠经过灌胃给药三个月后，与模型组相比，TFSC各剂量组小鼠的脑细胞凋亡率呈明显下降趋势，两者差异性有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　7.Western blot检测神经元细胞相关凋亡蛋白表达:与假手术组和雌激素对照组相比，模型组小鼠的海马神经细胞中的bax蛋白，Cyt-c蛋白和Caspase-3蛋白的表达增高，Bcl-2蛋白的表达显著性下降，其差异性有统计学意义(P＜0.01);连续灌胃给药3个月后，与模型组相比，TFSC各剂量组的海马神经细胞中Bax蛋白、Cyt-c蛋白和Caspase-3蛋白的水平呈明显的下降趋势，Bcl-2蛋白的水平呈明显的上升趋势，两者差异性有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　8.RT-PCR检测神经元细胞相关凋亡基因的表达:与假手术组和雌激素对照组相比，模型组小鼠海马区Bax mRNA和Cyt-c mRNA灰度值增加明显，表达显著升高，蛋白Bcl-2 mRNA条带灰度值显著降低，其差异性有统计学意义(P＜0.01);连续灌胃给药3个月后，与模型组相比，菟丝子总黄酮各剂量组小鼠海马区Bax mRNA、Cyt-c mRNA灰度值明显降低，表达量显著下降，Bcl-2mRNA的灰度值增加，上调了Bcl-2 mRNA表达，两者差异性有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01)。
　　结论:
　　1.摘除卵巢后，小鼠阴道上皮细胞角化消失，雌激素水平降低明显，学习记忆功能减退，初步证明内分泌衰退型痴呆模型建立成功。
　　2.TFSC可能通过增强小鼠体内地下丘脑-垂体-性腺轴的功能，改善小鼠的内分泌功能，进而使小鼠体内的雌激素水平上升，通过雌激素对神经细胞的保护作用从而能够改善小鼠的学习记忆能力，证明TFSC对海马神经细胞的有一定的保护作用。
　　3.TFSC可能通过上调Bcl-2蛋白和Bcl-2mRNA，下调Bax蛋白和BaxmRNA表达，使得线粒体内膜外侧渗漏孔关闭，从而抑制了Cyt-c的释放，继而进一步抑制和Caspase-9和Caspase-3级联反应的发生，从而减少神经细胞凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 内分泌衰退型小鼠痴呆模型的建立

1 材料

1．1 动物

1．2 药品与试剂

1．3 仪器

2 方法

2．1 药品与试剂的配制

2．2 动物模型的建立

2．3 分组与给药

2．4 取材及样本制备

2．5 模型验证

2．6 统计学分析

3 结果和分析

3．1 TFSC对小鼠子宫重量的影响

3．2 菟丝子对小鼠大脑海马区神经细胞病理形态的影响

3．3 菟丝子对小鼠阴道上皮细胞形态的影响

3．4 菟丝子对小鼠血清中雌激素含量的影响

4 讨论

第二部分 菟丝子总黄酮对去势小鼠模型学习记忆的影响

1 材料

1．1 动物

1．2 药品与试剂

1．3 仪器

2 方法

2．1 药品与试剂的配制

2．2 动物模型的建立

2．3 分组与给药

2．4 取材及样本制备

2．5 Morris水迷宫法检测小鼠的学习记忆能力

2．6 尼氏体染色

2．7 统计学分析

3 结果与分析

3．1 Morris水迷宫法检测菟丝子总黄酮对内分泌衰退型痴呆小鼠学习记忆的影响

3．2 TFSC对内分泌衰退痴呆小鼠小鼠的大脑海马神经元细胞中尼氏体的影响

4 讨论

第三部分 菟丝子总黄酮对去势小鼠大脑细胞凋亡基因BaxmRNA、Bcl-2mRNA、Cyt-CmRNA及凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyt-C表达的影响

1 材料

1．1 动物

1．2 药品与试剂

1．3 仪器

2 方法

2．1 动物模型的建立方法

2．2 分组与给药

2．3 取材及样本制备

2．4 流式细胞仪法检测小鼠海马神经细胞的凋亡率

2．5 免疫蛋白印迹法(western blotting)检测各组小鼠的大脑凋亡相关蛋白的表达

2．6 RT-PCR法检测小鼠大脑凋亡相关基因

2．7 统计学分析

3 结果与分析

3．1 TFSC对内分泌衰退型痴呆小鼠大脑神经元细胞凋亡率的影响

3．2 TFSC对内分泌衰退型痴呆小鼠大脑海马区神经元细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3．3 TFSC对内分泌衰退型痴呆小鼠大脑海马区神经元细胞凋亡相关基因的表达的影响

4 讨论

总结

参考文献

致谢

论文发表情况

个人简历