白僵菌素在构巢曲霉中异源表达的研究

摘要

目前存在的有生物活性的微生物次级代谢产物中，将近一半是由丝状真菌所产生的，里氏木霉、黑曲霉和产黄青霉等都是其中的典型代表。同时，丝状真菌作为异源蛋白表达的重要细胞工厂有着原核和酵母表达系统无法比拟的优势。因此作为异源表达系统的丝状真菌在发现多种多样的活性化合物等方面发挥着重要的作用，也越来越受到国内外的关注并取得非常显著的研究成果。因此，对真菌次级代谢产物的挖掘具有很重要的科学和实用价值，也为寻找更有效的抗耐药菌的药物提供了天然的聚宝盆，值得科学家们大力开发。丝状真菌的后基因组时代已经开启，不过由于很多丝状真菌的遗传操作和发酵培养体系不完善，或者最终产生的次级代谢产物的产量很低，以及在遗传背景和代谢调控上的复杂性等等问题都阻碍着对这些可能的新型活性化合物进行深入研究，急需科学工作者花很长时间去攻克。本研究中的白僵菌素是一种来自于海洋中筛选的层出镰刀菌Fusariumproliferatum LF061产生的环己缩脂肽类真菌毒素，属于思镰孢家族的一员，具有抗细菌、抗真菌、杀虫、抗病毒和生理毒性的作用。本实验室在2007年发现了低剂量的白僵菌素与低剂量的酮康唑可以发挥很好的互动抗真菌的效果，并且能够显著降低两者的使用剂量和毒副作用，有望成为新型的抗真菌复合药物的潜力。由于Fusarium proliferatum LF061在固体或者液体培养条件下产生白僵菌素的量很不稳定，而且此株菌的基因序列和遗传操作还不是很清楚。所以，我们选择在构巢曲霉中异源表达白僵菌素，期望可以达到较高的产量。
　　本文首先构建了包含白僵菌素合成酶和α-酮异戊酸还原酶的共表达载体pYWL21，通过PEG介导的原生质体转化技术将重组质粒整合到构巢曲霉A.nidulans RJMP1.59基因组上。将携带空载体pRG-AMAI的TYAH0和重组质粒pYWL21的TYAH1以及野生型菌株A.nidulans RJMP1.59一起进行摇瓶发酵，LC-MS检测到了白僵菌素在A.nidulans RJMP1.59的成功表达，产量最高达到了0.79mg/L。丝状真菌通常可以大量表达内源蛋白，在表达外源蛋白的时候产量却很低，已有文献报道了这些内源基因可能是由强启动子驱动表达的，因此，我们需要更强的启动子来增强基因的转录效率，进而高效表达目标产物。为了进一步地提高白僵菌素的产量，我们使用了组成型的3-磷酸甘油醛脱氢酶的强启动子gpdAP和木糖诱导型的强启动子xylP来联合表达白僵菌素合成酶或者α-酮异戊酸还原酶。与在构巢曲霉中利用白僵菌素生物合成基因簇中内源性启动子进行异源表达相比，强启动子的驱动表达使得白僵菌素的产量提高了5倍多，最高达到了4.52mg/L。在丝状真菌发酵培养的过程中，微生物的菌体生长形态与发酵产物的种类与产量上有着很大的关联。同时，摸索出更适合的发酵培养基的成分以及发酵工艺对于产量提高也是十分必要的。本论文在优化白僵菌素的产量的时候，起初从无机微粒的添加入手，着力解决发酵液粘稠导致的产量低下问题，接着综合考虑发酵培养的温度、时间和前体供应等，最终得到白僵菌素的产量最高达到了668.97mg/L。通过在构巢曲霉中异源表达白僵菌素合成酶和α-酮异戊酸还原酶成功获得了白僵菌素，并且产量最高达到了668.97mg/L，这些方法和结果一方面为我们继续优化白僵菌素的产量提供了前期基础，另一方面也为挖掘更多的环缩脂肽类化合物提供了新的依据，对发现更多新颖活性化合物具有重要的意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 异源表达非核糖体肽类化合物的研究进展

1．1．1 非核糖体肽类化合物概括

1．1．2 非核糖体肽的异源生物合成研究

1．1．3 常见的微生物异源表达系统

1．2 白僵菌素的研究进展

1．2．1 白僵菌素概况

1．2．2 白僵菌素的生物合成

1．3 本论文的主要内容与研究意义

1．3．1 研究内容

1．3．2 研究意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 引物

2．1．3 培养基和常用试剂配制

2．1．4 试剂和试剂盒

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 目的基因片段的PCR扩增

2．2．2 DNA的琼脂糖凝胶电泳实验

2．2．3 目的基因片段的回收纯化

2．2．4 DNA的酶切与Gibson Assembly反应体系

2．2．5 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

2．2．6 质粒DNA的小量提取

2．2．7 乙醇沉淀回收DNA

2．2．8 构巢曲零孢子的保藏与孢子悬液的制备

2．2．9 构巢曲霉原生质体的制备与转化

2．2．10 构巢曲霉基因组的小量抽提

2．2．11 白僵菌素的摇瓶发酵工艺

2．2．12 白僵菌素发酵液的萃取与旋蒸

2．2．13 白僵菌素发酵液的HPLC检测

第三章 白僵菌素在构巢曲霉中的异源表达

3．1 引言

3．2 结果与分析

3．2．1 白僵菌素异源表达载体的构建

3．2．2 构巢曲霉异源表达转化子的筛选

3．2．3 白僵菌素在构巢曲霉中的LC-MS鉴定

3．3 小结与讨论

第四章 重构启动子增加白僵菌素产量

4．1 引言

4．2 结果与分析

4．2．1 不同启动子异源表达载体的构建

4．2．2 白僵菌素异源转化子的筛选

4．2．3 不同启动子表达对白僵菌素产量的影响

4．3 小结与讨论

第五章 白僵菌素发酵工艺的优化

5．1 引言

5．2 结果与分析

5．2．1 添加滑石粉来提高白僵菌素的产量

5．2．2 白僵菌素表达菌株TYAH2生长曲线的摸索

5．2．3 优化发酵条件来提高白僵菌素的产量

5．3 小结与讨论

第六章 总结与展望

参考文献

致谢