FlrA调控希瓦氏菌生物膜形成的机制研究

摘要

腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一类最常见的水产品腐败菌，其分布广泛、营养要求低、低温下生长较快，极易在食品加工和贮藏过程中造成腐败。由于希瓦氏菌易粘附于载体接触面形成很难去除的生物膜，在环境中留下隐蔽的污染源，威胁人类健康和环境安全。因而，在食品安全领域，控制希瓦氏菌数量、去除生物膜成为难题。
　　对很多希瓦氏菌而言，BpfA蛋白是生物膜形成的关键的粘附素。实验室前期研究表明在有氧条件下，DosD（环二鸟苷酸环化酶）催化作用使c-di-GMP(环二鸟苷酸)水平升高，从而促进BpfA表达。本文以腐败希瓦氏菌野生型菌株S.putrefaciens CN32作为研究对象，通过lacZ报告菌株进行转座子突变，确定FlrA是bpfA操纵子重要的转录调控因子，再通过一系列实验探究FlrA具体的转录机制。通过β-半乳糖苷酶活性分析、qRT-PCR实验和生物膜表型实验进行初步验证，进一步借助EMSA、DNaseⅠ足迹迁移实验、FP、CHIP-qPCR和定点突变等实验探究转录因子的作用机制。
　　分析结果表明:FlrA是bpfA操纵子的转录抑制子，它结合启动子的区域覆盖-10区和-35区，同时被σ70识别。FlrA介导DosD调控bpfA操纵子的表达，环二鸟苷酸(c-di-GMP)解除FlrA与bpfA操纵子的启动子区结合。我们也发现FlhG，鞭毛合成的关键蛋白，抑制FlrA对bpfA操纵子的表达调控，并取决于FlrA。本课题研究表明在腐败希瓦氏菌CN32中，FlrA作为从环二鸟苷酸(c-di-GMP)到BpfA相关生物膜形成信号通路的关键媒介。本文通过研究影响生物膜形成的因子，探讨生物膜形成的机制，为生物膜的去除提供可调控的靶点，并为进一步研究调控生物膜的形成奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 希瓦氏菌

1．1．1 希瓦氏菌简介

1．1．2 希瓦氏菌的生理特性

1．1．3 希瓦氏菌的危害

1．2 生物膜

1．2．1 生物膜简介

1．2．2 生物膜结构特点

1．2．3 腐败希瓦氏菌生物膜研究现状

1．3 bpfA操纵子

1．4 论文研究目的，研究内容和方案

第二章 FlrA、FlhG对bpfA操纵子的表达调控

2．1 实验材料

2．1．1 主要仪器和试剂配制

2．1．2 溶液和培养基

2．1．3 菌株、质粒和引物序列

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的培养及保存

2．2．2 3591Z报告菌株构建

2．2．3 突变菌株和回复突变菌株构建

2．2．4 生长和酶活测定

2．2．5 RNA抽提和qRT-PCR

2．3 结果与讨论

2．3．1 FlrA、FlhG对bpfA操纵子表达的影响

2．3．2 FlrA、FlhG对bpfA转录的影响

2．4 小结

第三章 FlrA、FlhG对生物膜形成的调控

3．1 实验材料

3．1．1 主要仪器和试剂配制

3．1．2 溶液和培养基

3．1．3 菌株、质粒和引物序列

3．2 实验方法

3．2．1 菌株的培养及保存

3．2．2 突变菌株和回复突变菌株构建

3．2．3 生物膜形成和量化

3．3 结果与讨论

3．4 小结

第四章 FlrA对bpfA操纵子的调控机制研究

4．1 实验材料

4．1．1 主要仪器和试剂配制

4．1．2 溶液和培养基

4．1．3 菌株、质粒和引物序列

4．2 实验方法

4．2．1 菌株的培养及保存

4．2．2 构建表达菌株

4．2．3 FlrA蛋白纯化

4．2．4 凝胶电泳迁移实验

4．2．5 CHIP和qRT-PCR分析

4．2．6 DNase I footprinting

4．2．7 引物延伸分析

4．2．8 定点突变

4．2．9 酶活测定

4．3 结果与讨论

4．3．2 ChIP-qPCR说明FlrA是bpfA操纵子的抑制子

4．3．3 DNase I FootPrinting确定了FlrA与启动子结合位点

4．3．4 定点突变评估启动子的转录活性

4．4 小结

第五章 c-di-GMP对FlrA与bpfA启动子结合的调控

5．1 实验材料

5．1．1 主要仪器和试剂配制

5．1．2 溶液和培养基

5．1．3 菌株、质粒和引物序列

5．2 实验方法

5．2．1 菌株的培养及保存

5．2．2 荧光偏振

5．2．3 突变菌株构建

5．2．4 酶活测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 c-di-GMP对FlrA与bpfA启动子结合的影响

5．3．2 DosD对bpfA操纵子的影响

5．4 小结

第六章 总结

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

作者在攻读硕士期间发表的论文