云芝细胞色素P450还原酶TvCPR和毛栓菌CYP酶ThCYP53-1在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析

摘要

细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)酶可能是最具催化作用多样性的生物催化剂。白腐真菌能够降解许多难降解有机污染物，除了其胞外木质素降解酶系，其胞内的细胞色素P450酶系(cytochrome P450s，CYPs)的降解功能也越来越引起人们的关注。白腐真菌可以依赖CYP酶系脱毒和降解环境中的各种外源化合物，如多环芳烃、酚类、固醇类和烷烃等化合物。毛栓菌Trametes hirsutaAH28-2与云芝Trametes versicolor都属于白腐真菌。实验室前期研究发现毛栓菌外加邻甲苯胺诱导时其胞内的CYP基因转录水平上调，表明毛栓菌的P450系统参与对外源芳香族化合物的响应。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR)是一类以FMN（黄素单核苷酸）和FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）为辅基的氧化还原酶，CPR是CYP的主要电子供体，与CYP的电子传递反应是CYP氧化还原反应的限速步骤。
　　单独表达、纯化CPR和CYP，并对其进行酶学特性的分析为体外构建CYP酶反应体系，研究CPR和不同家族的CYPs之间的相互作用，以及比较CPR和其它不依赖于CPR的CYP电子传递体（如细胞色素b5和NADH依赖的细胞色素b5还原酶）之间的差别奠定基础。目前已有一些关于CPR在大肠杆菌中异源表达和功能鉴定的报道。为利于CPR在大肠杆菌细胞内高效可溶性表达，通常的策略是对其N端膜结合的疏水区域进行序列改造或者截除。真核生物的CYP也是膜结合蛋白，通常也利用N端疏水区域替换或去除的策略实现其在大肠杆菌中的可溶且活性形式的表达。
　　本研究首先将云芝Trametes versicolor的全长CPR和去除预测的N端膜锚定区域（第1-24个氨基酸残基）的CPR△24分别在大肠杆菌中异源表达，最终获得可溶性表达的CPR△24蛋白，对该蛋白进行纯化，并对其酶学特性进行分析，结果表明重组CPR△24的分子量与理论值78.35 kDa一致。镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后测得其比活性为5.82 U/mg。酶学性质分析显示，CPR△24的最适温度和pH分别为35℃和8.0，并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性。重组CPR△24在35℃和pH8.0反应条件下对NADPH的动力学参数Km和kcat分别为19.7μM，3.31/s;对底物细胞色素c的动力学参数Km和kcat分别为25.9μM，10.2/s。
　　本研究其次将毛栓菌Trametes hirsuta AH28-2中的一个CYP ThCYP53-1在大肠杆菌中异源表达。通过去除N端膜锚定区域，使用sumo融合标签以及与分子伴侣pGro7共表达的方法，最终实现重组ThCYP53-1的可溶性表达。ThCYP53-1属于CYP53家族，该家族成员具备苯甲酸-4-羟化酶活性。本研究为进一步构建CYP体外生物反应酶系，探究云芝CPR和不同的细胞色素P450酶CYPs之间的相互作用，以及研究云芝CPR和CYPs在环境有机污染物降解途径中的功能提供指导。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 白腐真菌在环境污染物降解中的应用

1．1．1 云芝

1．1．2 毛栓菌AH28-2

1．2 细胞色素P450与细胞色素P450还原酶

1．2．1 细胞色素P450

1．2．2 细胞色素P450还原酶

1．3 细胞色素P450还原酶细胞色素P450相互作用

1．4 本课题的主要研究内容及研究目的、研究意义

1．5 本课题技术路线图

第二章 CPR基因的克隆与异源表达

2．1 实验材料

2．1．1 基因与载体

2．1．2 仪器与试剂／酶

2．2 实验方法

2．2．1 试剂和溶液的配制

2．2．2 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备

2．2．3 获取目的片段

2．2．4 云芝CPR氨基酸序列分析

2．2．5 构建重组表达质粒pET28-cpr和pET28-cprA24

2．2．6 重组质粒pET28-cpr和per28-cpr的转化和鉴定

2．2．7 外源蛋白的诱导表达

2．3 结果

2．3．1 获取目的片段

2．3．2 云芝CPR氨基酸序列分析

2．3．3 重组质粒的转化和鉴定

2．3．4 重组蛋白的诱导表达

2．4 讨论

第三章 CPRΔ24蛋白的纯化和性质分析

3．1 实验材料

3．1．1 菌株与蛋白

3．1．2 仪器／试剂与酶

3．2 实验方法

3．2．1 溶液和试剂的配制

3．2．1 镍柱纯化

3．2．2 分子筛纯化

3．2．3 CPRA24比酶活测定

3．2．4 CPRA24酶学特性分析

3．2．5 动力学参数的表征

3．3 结果

3．3．1 重组蛋白的纯化

3．3．2 酶活测定

3．3．3 酶学特性分析

3．3．4 动力学参数的表征

3．4 讨论

第四章 CYP基因Thcyp53-1的克隆与异源表达

4．1 实验材料

4．1．1 菌株与载体

4．1．2 仪器与试剂／酶

4．2 实验方法

4．2．1 试剂的配制

4．2．2 培养基的配制

4．2．3 E．coli BL21(DE3)感受态细胞的制备

4．2．4 毛栓菌Trametes hirsuta All 28-2的培养

4．2．7 Thcyp53-1的PCR扩增

4．2．8 Thcyp53-1目的条带的验证及胶回收

4．2．11 双酶切后的目的基因和载体的胶回收

4．2．15 重组质粒pET28-Thcyp53-1和分子伴侣质粒pGro7共表达体系的构建

4．2．16 重组质粒pET28-Thcyp53-1和分子伴侣质粒pGro7共表达鉴定

4．3 结果

4．3．1 RNA抽提

4．3．3 重组质粒pET28-Thcyp53-1的转化和鉴定

4．3．4 外源蛋白的诱导表达

4．3．5 重组质粒pET28-Thcyp53-1和分子伴侣质粒pGro7共表达鉴定

4．4 讨论

展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文