单分子荧光探针观测细胞内气体信号分子对磷酸酶活性的调节

摘要

细胞内几乎所有的代谢过程都需要酶的参与，因此酶在生物体内扮演着重要的角色。酶活性水平的异常已经作为一些疾病的诊断标志，甚至与多种癌症直接相关，故而确定酶的活性水平对酶活性的调控和临床诊断具有重要的意义。研究表明活细胞内酶的活性受到小分子气体递质的调控以维持其正常的生理学功能。近年来，科研工作者们已经成功开发出一些新型的小分子荧光探针并且分别实现了对活细胞内酶活性水平的检测以及小分子气体递质的可视化成像。但是原位揭示细胞内小分子气体递质对酶活性水平的调控仍然是目前长期存在的难题。 在这篇论文中，我们报道了一种具有双反应位点的单分子荧光探针，并且通过多通道荧光成像法实现了活细胞中磷酸酶的活性水平对H2S浓度依赖的可视化检测。主要的研究内容如下: 1.在大量文献调研的基础上，我们设计了一个能够同时与H2S和磷酸酶反应的单分子荧光探针。于香豆素荧光团母体上修饰以选择性与H2S反应的叠氮基团(-N3)，于Rhodol荧光团母体(一种荧光素与罗丹明混合结构的氧杂蒽类染料)上修饰以与磷酸酶特异性反应的磷酸酯，经过修饰的两个荧光团母体通过哌嗪环耦合成双反应位点的单分子荧光探针。并且通过取代反应、叠氮化反应、酰胺化等反应成功合成了探针分子N3-CR-PO4，经过分离纯化后通过质谱和核磁对探针分子进行了表征。 2.探针分子与H2S反应后，香豆素荧光团母体的蓝色荧光被打开;探针分子单独与磷酸酶反应时，Rhodol荧光团母体上的磷酸酯被水解成磷酸基团离去，探针发出绿色的荧光;当H2S与磷酸酶同时与探针分子反应时，从香豆素母体到Rhodol荧光团母体会发生荧光共振能量转移，整个系统发出绿色荧光。以此构建了三通道荧光成像的方法。 3.基于三通道荧光成像的方法，实现了探针分子N3-CR-PO4对正常细胞和癌细胞中H2S和磷酸酶的可视化检测。实验结果表明，H2S的水平稍微偏离正常值，磷酸酶的活性会迅速降低，并且进一步通过两种商业探针和试剂盒证实了该结果。这个发现进一步加深了我们对H2S在细胞信号传递以及磷酸酶相关的各种人类疾病中的重要性的理解。